类器官&肿瘤球&细胞增殖、活力、毒性检测全攻略

一、概述

在生物医学研究的广阔领域中，细胞活性检测扮演着至关重要的角色。它不仅帮助科学家们评估细胞的生存状态，还能深入了解细胞对药物、环境变化或病理过程的响应。类器官/肿瘤球/细胞活性检测通常包括测量细胞增殖、细胞毒性和细胞死亡等方面。今天，小爱向大家介绍器官/肿瘤球/细胞活性检测的六大常用方法：细胞代谢检测方法、DNA合成检测方法、细胞ATP检测方法、荧光染料检测方法、细胞膜通透性检测方法、细胞LDH检测方法。

细胞增殖、活力、毒性检测方法大全

二、检测方法

1、细胞代谢检测方法

基于细胞代谢物进行的检测方法有CCK8法(abs50003)、MTT法(abs50010)、MTS法(abs50011)、WST-1法(abs44133679)、XTT法(abs42088663)。今天，小爱给大家着重比较一下CCK8法和MTT法。

cck-8法和MTT法都是适合大规模、快速评价药物的方法。与MTT相比较，cck-8法优势明显。在一定细胞数范围内，cck-8检测OD值与活细胞数的线性关系比MTT法明显。而且，MTT法产生不溶于水的蓝紫色结晶，需要有机溶剂DMSO溶解，操作过程中常会出现溶解不wan全或细胞丢失的现象，影响结果的准确性。cck-8法只是加染料的一步操作，操作简单，检测可实时，免去了去除培养基的操作，是细胞增殖、活力、毒性的主流方法。对环境保护更为有利，不使用有机溶剂DMSO，所需的耗材也少。

下边是两个检测试剂盒的各方面优势比较：

2、DNA合成检测方法

基于DNA合成进行的检测方法有Brdu法(abs811906)、EdU-488法(abs50050)、EdU-555法(abs50051)、EdU-594法(abs50052)、EdU-647法(abs50053)。今天，小爱给大家着重介绍一下EDU法。

EdU(5-ethynyl-2'-deoxyuridine)，中文名为5-乙炔基-2'-脱氧尿苷，是一种胸腺嘧啶核苷类似物，其炔羟基团在天然化合物中很少见，在细胞增殖时能够替代胸苷（胸腺嘧啶脱氧核苷，thymidine）插入正在复制的DNA分子中， EdU上的乙炔基能与荧光标记的小分子叠氮化物探针（如Azide Alexa Fluor 488等）通过一价铜离子催化发生共价反应，形成稳定的三唑环，该反应非常迅速，被称作点击反应(Clickreaction)，从而可以进行高效快速的检测细胞增殖，特别是可以有效地检测处于S期的细胞百分数。与传统的免疫荧光染色(BrdU)检测方法相比， EdU只有BrdU抗体大小的1/500，在细胞内更容易扩散，不需要严格的样品变性（酸解、热解、酶解）处理，有效地避免了样品损伤，有助于在组织、器官的整体水平上观测细胞增殖的真实情况，具有更高的灵敏度和更快的检测速度。

3、细胞ATP检测方法

基于细胞ATP进行的检测方法有2D-ATP法(abs50065)（细胞适用）；3D-ATP法(abs50057)（类器官、肿瘤球适用）；2D/3D-ATP法(abs50059)（细胞、类器官、肿瘤球均适用）。今天，小爱给大家着重比较一下这3种方法的异同点。

相同点：以上3种方法均是借助ATP依赖的荧光素酶催化的荧光素发光反应，通过化学发光信号测定细胞内ATP含量，从而检测细胞活力或定量检测活细胞数目，检测线性范围宽、灵敏度高、稳定性好。96孔板中，在100个至100,000个细胞范围内有良好的线性关系，但不同细胞的检测数量上限会有不同。此外，操作简单，试剂盒中提供的检测试剂为即用型，读数稳定，检测速度快，完成检测仅需约10min，无需洗涤细胞，也无需更换或去除培养液。

不同点：2D-ATP法(abs50065)适用于2D细胞培养体系；而像类器官/肿瘤球这种介于细胞和组织之间的结构需要裂解能力更强的ATP检测试剂盒，故3D-ATP法(abs50057)采用的试剂裂解能力更强，适用于类器官、肿瘤球的ATP检测；而2D/3D-ATP法(abs50059)是一款通用型试剂，兼具细胞、类器官、肿瘤球检测功能，通用性更强。有关类器官、肿瘤球ATP检测攻略可以查看链接3D肿瘤球&类器官药敏活性检测攻略。

4、荧光染料检测

基于荧光染料进行的检测方法有活细胞示踪法(abs50060)、活/死细胞双染法(abs50056)（类器官、肿瘤球常用）、CFSE染色法(abs9106)、Calcein AM染色法(abs42014734)。今天，小爱给大家着重介绍一下活细胞示踪法和活/死细胞双染法。

（1）活细胞示踪法

研究细胞运动和定位，需要用到对活细胞无毒的专一性探针。Live Cell Tracking Kit提供了一种通用且保存良好的细胞跟踪试剂(Cell Tracker Green)，用于监测细胞的运动，定位，增殖，迁移，趋化性和侵袭性。Cell Tracker Green是一种活细胞荧光示踪探针，可以通过被动扩散进入细胞，与细胞内蛋白共价结合，是一种长效细胞示踪染料。一旦进入细胞，非荧光性的Cell Tracker Green会被胞内酯酶水解，产生绿色荧光(Ex/Em=494/521nm)。这些荧光产物只能积聚在具有完整细胞膜的细胞中，因此死细胞和无完整细胞膜不能被染色。Cell Tracker Green对pH变化不敏感，可以由甲醛或戊二醛固定。Cell Tracker Green探针可以在活细胞中保留好几代，并可以显示荧光至少一周。探针可被转移到子细胞，但是不转移到群体中的相邻细胞。

（2）活/死细胞双染法

在类器官的培养过程中，如果我们想了解类器官的增殖及凋亡状态，可以通过对活细胞和死细胞进行荧光染色，通过荧光显微镜拍照观察。

Calcein-AM是一种对活细胞进行荧光标记的细胞染色试剂，发绿色荧光(Ex=490nm，Em=515nm)。因其在传统的Calcein（钙黄绿素）基础上引入乙酰甲氧基甲酯(AM)基团，增加了疏水性，使其能够轻易穿透活细胞膜。一旦进入细胞后，Calcein-AM（本身不发荧光）被细胞内的酯酶剪切形成膜非渗透性的极性分子Calcein，从而被滞留在细胞内并发出强绿色荧光。与其它同类试剂（如BCECF-AM和CFDA）相比，由于Calcein-AM细胞毒性极低，是较适合用于活细胞染色的荧光探针，而且不会抑制任何的细胞功能，如增殖和淋巴球的趋化性。

由于死细胞缺乏酯酶，Calcein-AM仅用于对活细胞的细胞生存能力测试和短期标记。因此，Calcein-AM常常与死细胞荧光探针如碘化丙啶(PI)等联合使用，同时进行活细胞和死细胞的荧光双重染色。碘化丙啶(Propidium iodide，PI)不能穿过活细胞的细胞膜，仅能穿过死细胞膜的无序区域而到达细胞核，并嵌入细胞的DNA双螺旋从而产生红色荧光(Ex=535nm，Em=617nm)，因此PI仅对死细胞染色。由于Calcein和PI-DNA都可被490nm激发，因此可用荧光显微镜同时观察活细胞和死细胞。而用545nm激发，仅可观察到死细胞。

活细胞/死细胞双染试剂盒(abs50056)的工作原理就在于Calcein-AM和PI的双重染料，来进行活细胞和死细胞的双重染色标记，从而进行活细胞和死细胞水平的分析。根据我司优化的实验体系，以24孔板，每孔25uL类器官基质胶凝聚物为例，每孔添加500uL染色工作液进行染色。具体实验步骤可参考链接类器官原位活死染色实验攻略。

5、细胞膜通透性检测

基于细胞膜通透性进行的检测方法有台盼蓝染色细胞存活率检测试剂盒(abs50036)、伊红染液(abs9222)、中性红染色液（0.33%，活细胞染色用）(abs42154867)。

台盼蓝或伊红染色法，是利用正常的健康细胞能够排斥台盼蓝或伊红，而丧失细胞膜完整性的细胞可以被台盼蓝或伊红染色。台盼蓝或伊红染色检测的是细胞膜的完整性，通常认为细胞膜丧失完整性，即可认为细胞已经死亡。台盼蓝或伊红染色后，通过显微镜下直接计数或显微镜下拍照后计数，就可以对细胞存活率进行比较精确的定量。

中性红是一种弱碱性染料，同时也是一个pH指示剂，其变色范围在pH值6.4至8.0之间（由红变黄）。中性红染色常用于鉴定动物细胞的死活。活细胞被染成红色，而死细胞则不变色，这种方法与台盼蓝染色法相反。通过测定细胞对中性红的摄入量，可以评估细胞的增殖或毒性情况。

6、细胞LDH检测

基于细胞LDH进行的检测方法是LDH法(abs580007)。LDH检测的原理基于乳酸脱氢酶（Lactate Dehydrogenase，简称LDH）的特性。以下是LDH检测试剂盒(abs580007)的详细原理：

（1）LDH的分布与释放：LDH是一种广泛存在于各种生物体中的稳定的胞浆酶，正常情况下不能通过细胞膜。当细胞受到损伤或死亡时，细胞膜的完整性被破坏，LDH被释放到细胞外的培养基中。

（2）LDH活性的测定：LDH催化乳酸形成丙酮酸盐，同时在这个过程中，NAD+被还原生成NADH。NADH和四唑盐类化合物INT(2-p-iodophenyl-3-nitrophenyl tetrazolium chloride)在硫辛酰胺脱氢酶(Diaphorase)的催化下反应生成红色的甲臜(Formazan)。

（3）颜色变化与细胞损伤的关系：甲臜的量与裂解（死亡）的细胞数成正比。在490nm波长下，甲臜产生吸收峰，可以通过比色来检测细胞培养液、细胞裂解液等样品中LDH的活性。吸光度与LDH活性成线性正相关，即与裂解（死亡）细胞数呈正相关。

（4）实验操作：实验中，将不同处理组的细胞培养液离心，将上清液移到96孔板中，加入LDH检测试剂，反应一定时间后可以通过酶标仪或分光光度计测定释放的LDH活性。通过比较不同组细胞释放的LDH活性可以判断细胞损伤情况的大小。

（5）应用：LDH释放检测主要应用于评估细胞毒性和细胞死亡情况，在药物筛选、毒理学研究、细胞培养中都有广泛的应用。同时，在一些疾病的诊断和治疗中，如心肌梗塞、肝炎、癌症等也有一定的参考价值。

综上所述，LDH检测是一种通过测定细胞培养上清中LDH活性来评估细胞损伤程度的方法，其灵敏度、方便性和精确性使其成为细胞毒性分析中的一个重要工具。

今天讲解就到这了，大家如有细胞和类器官实验问题，欢迎一起交流哦！

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