小鼠背根神经节取材及电穿孔转染条件优化

一、引言

二、材料与方法

（一）实验动物

（二）主要试剂与仪器

1. 试剂

• 含有目的基因的质粒（自行构建并鉴定）。

• 细胞培养液（DMEM 高糖培养基，添加 10% 胎牛血清、1% 青霉素 - 链霉素）。

• 麻醉剂。

• 电穿孔缓冲液（自行配制，含特定浓度的无机盐和缓冲物质）。

2. 仪器

• 精密手术器械（显微镊、显微剪等）。

• 电穿孔仪（具备可调节电压、电容和脉冲时间等参数功能）。

• 细胞培养箱（可精确控制温度、CO₂浓度和湿度）。

（三）小鼠背根神经节取材

1. 麻醉小鼠

• 按照 50mg/kg 的剂量腹腔注射麻醉剂，待小鼠进入深度麻醉状态（通过观察小鼠对疼痛刺激无反应，如夹尾无挣扎等）。

2. 消毒与定位

• 将小鼠背部皮肤用 75% 酒精棉球消毒，然后将小鼠置于解剖台上，俯卧位固定。依据小鼠的解剖结构，确定脊柱位置，标记出需要取材的背根神经节节段（通常为腰段）。

3. 手术操作

• 沿标记线用显微剪小心剪开皮肤和肌肉组织，逐层分离，避免损伤周围血管和神经。在显微镜下，清晰地暴露脊柱，轻轻去除椎骨周围的结缔组织，用精细的显微镊小心分离出背根神经节，尽量保持神经节的完整性及其周围神经纤维的连接。

4. 神经节处理

• 将取下的背根神经节迅速转移至预冷的细胞培养液中，清洗 2 - 3 次，以去除表面的血液和杂质，然后放置在冰上备用。

（四）电穿孔转染实验

1. 细胞准备

• 将清洗后的背根神经节转移至电穿孔缓冲液中，轻轻吹打，使神经节细胞分散均匀。

2. 电穿孔参数设置与分组

• 设置多组电穿孔参数实验，包括不同的电压（如 100V、150V、200V 等）、电容（如 25μF、50μF、100μF 等）和脉冲时间（如 5ms、10ms、20ms 等）。将神经节细胞与含有目的基因的质粒混合均匀后，分别按照不同参数组合进行电穿孔转染操作。

3. 转染后培养

• 电穿孔转染完成后，将细胞转移至含有完整培养液的培养皿中，置于细胞培养箱中培养。在培养 24 小时、48 小时和 72 小时后，分别收集细胞，采用荧光定量 PCR 和 Western blot 技术检测目的基因的表达情况，以评估转染效率。

三、结果

（一）取材效果评估

（二）电穿孔转染结果

1. 不同电压对转染效率的影响

• 在电容和脉冲时间固定的情况下，随着电压的升高，转染效率呈现先上升后下降的趋势。例如，当电容为 50μF、脉冲时间为 10ms 时，150V 电压下转染效率高，目的基因的表达量较 100V 时提高了约 50%，而 200V 时由于过高的电压导致细胞损伤，转染效率下降，目的基因表达量较 150V 时降低了约 40%。

2. 不同电容对转染效率的影响

• 在电压和脉冲时间恒定的条件下，电容的变化也对转染效率有显著影响。以电压 150V、脉冲时间 10ms 为例，50μF 电容时转染效率佳，较 25μF 时目的基因表达量提高了约 35%，而 100μF 时由于电容过大，引起细胞内环境过度变化，转染效率略有下降，目的基因表达量较 50μF 时降低了约 20%。

3. 不同脉冲时间对转染效率的影响

• 当电压和电容固定时，脉冲时间的改变影响转染效率。如电压 150V、电容 50μF 时，10ms 脉冲时间下转染效果好，目的基因表达量较 5ms 时提高了约 45%，但 20ms 脉冲时间过长，导致细胞应激反应增强，转染效率下降，目的基因表达量较 10ms 时降低了约 30%。

四、讨论