Regulation of the integrin αVβ3- actin filaments axis in early osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells under cyclic tensile stress
Keywords: Integrin αVβ3; Mesenchymal stem cells; Osteogenesis; Tensile stress; Yes-associated protein (YAP).
骨搬运技术是目前修复肢体骨缺损的主要方法之一。在骨修复的过程中，牵张应力刺激细胞的增殖与分化，从而实现骨与软组织的同步再生。目前如何修复大骨缺损的一个重要研究方向是如何在体内促进干细胞的成骨分化。其中，间充质干细胞（MSCs）是具有成骨、成软骨、成脂肪和成肌分化功能的多能细胞，在再生医学中具有巨大的潜力。
整合素是一类重要的细胞表面受体，由α亚基和β亚基以非共价键结合形成的跨膜异二聚体糖蛋白。整合素通过募集多种细胞内蛋白并将细胞内微丝细胞骨架与细胞外基质（ECM）连接起来形成黏着斑复合物，从而将机械信号从细胞外部传递到细胞内部。YAP 是一种转录共激活因子，可与 TEAD-DNA 结合蛋白结合以促进细胞增殖并调节干细胞分化。然而，循环牵张应力（CTS）影响细胞内 YAP 表达从而调节 MSCs 成骨的机制仍不清楚。
鉴于整合素与机械转导的密切相关，广东省医学3D打印与生物力学重点实验室欧阳钧教授科研团队在一项研究中探讨了人间充质干细胞成骨过程中牵张应力和整合素αVβ3对细胞分化的影响。研究表明，整合素αVβ3 在循环牵张应力诱导的 MSCs成骨过程中表达增加，其活化可导致肌动蛋白丝结构的重排，从而调控 YAP 核定位，且机械信号通过 αVβ3-微丝轴影响 MSCs 的成骨。这表明，αVβ3 可能在干细胞水平上作为骨修复的新靶点。研究成果发表在 Cell Communication and Signaling 期刊题为“Regulation of the integrin αVβ3- actin filaments axis in early osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells under cyclic tensile stress”。
首先，研究调查了 MSCs 中循环牵张应力（10%形变，0.5 Hz频率，2 h/d，7d）与早期成骨分化之间的关系，与对照组相比，CTS负荷 7 天后 MSCs 中成骨标志物 ALP 和 RUNX2 的蛋白质和 mRNA 表达增加，这表明，循环牵张应力可促进 MSCs 的早期成骨分化。
然后，通过qRT-PCR 分析整合素αVβ3 的表达水平以验证整合素是否参与循环牵张应力诱导的 MSCs 成骨分化。结果发现，在循环牵张应力下整合素αVβ3 的表达高于对照组，表明循环牵张应力促进了整合素αVβ3 的表达。
因此，继续研究整合素αVβ3 与循环牵张应力诱导的 MSCs 早期成骨分化之间的关系。通过整合素αVβ3 的拮抗剂 RGDyk抑制整合素αVβ3 在 MSCs 中的功能，发现与 CTS 组相比，RGDyk 组的 ALP 染色较浅（图1 a）。Western blotting 显示，当 MSC 整合素αVβ3 受到抑制时，RGDyk 组的成骨标志物 ALP 和 RUNX2 的表达相对于 CTS 组降低（图1 b）。此外，当整合素αVβ3 功能受到抑制时，ALP 和 RUNX2 的 mRNA 表达也降低（图1 c）。以上结果表明，循环牵张应力可以通过整合素αVβ3 的表达和活化影响 MSCs 的早期成骨分化。
图1 CTS 通过整合素αVβ3 调节 MSCs 成骨分化的早期阶段。（a） CTS 下GM、CTS 和 RGDyk 组的 ALP 染色。（b）CTS 下GM 和 RGDyk 组 ALP 和 RUNX2 的蛋白表达。（c）CTS 下GM 和 RGDyk 组 ALP 和 RUNX2 的 mRNA 表达。实验分组：在生长培养基中未分化的 MSCs（GM 组）、循环牵张应力施加 7 天的 MSCs（CTS 组）、在循环牵张应力下用 RGDyk 处理的 MSCs（RGDyk 组）、在循环牵张应力下用细胞松弛素D 处理的 MSCs（CytoD 组）和在循环牵张应力下用维替泊芬处理的 MSCs（VP 组）。
黏着斑复合物连接整合素αVβ3 和肌动蛋白丝，并以此来传导机械信号。因此，接下来探讨了黏着斑相关蛋白踝蛋白（Talin-1）、黏着斑激酶（FAK）和纽蛋白（Vinculin）在循环牵张应力下的表达，并检测了talin-1、FAK 和vinculin 在整合素αVβ3 激活下的表达。Western blotting 和 qRT-PCR 结果表明，与对照组相比，循环牵张应力有效提高了 MSCs 中三者的表达水平。使用RGDyk抑制整合素αVβ3功能后，RGDyk组其表达水平相对于CTS组降低。
免疫荧光显示，未经牵张应力加载时细胞膜周边可见零星点状黏着斑复合体，而在循环牵张应力负荷后，黏着斑复合体显著增多。当整合素 αVβ3 功能受到抑制时，黏着斑复合体又显著减少。这表明，循环牵张应力通过激活整合素 αVβ3 增加 MSCs 中黏着斑的形成。
通过western blotting和qRT-PCR实验，发现在循环牵张应力的作用下，β-肌动蛋白（β-actin）的表达升高（图2 a）。为了了解机械转导过程中整合素αVβ3 和肌动蛋白丝之间的关系，进一步检测了抑制整合素αVβ3 后 β-actin 表达的变化。结果显示，与 CTS 组相比，MSCs 中 RGDyk 组的 β-actin表达水平降低（图2 a）。免疫荧光实验显示，GM 组肌动蛋白丝排列平直紧密，呈细长丝状，但在循环牵张应力下形成较粗壮的应力纤维丝，排列方向不规则且微丝结构向细胞膜方向聚拢。当整合素αVβ3 受到抑制时，肌动蛋白应力纤维丝略微增厚，并类似于 GM 组呈平直紧密方式排列（图2 c）。以上结果表明，循环牵张应力通过整合素αVβ3 调节 β-actin的表达并影响肌动蛋白丝的结构。
此外，为了研究肌动蛋白丝与循环牵张应力诱导的 MSCs 成骨分化之间的关系，使用细胞松弛素D（cytochalasin D）来抑制肌动蛋白丝的聚合。结果显示，细胞松弛素D 在牵张应力下降低 ALP 和 RUNX2 的表达（图2 d），这表明，循环牵张应力可以通过整合素αVβ3-肌动蛋白丝轴促进 MSCs 的早期成骨分化。
图2 肌动蛋白丝通过 MSC 中的整合素αVβ 的激活调节 CTS 诱导的早期阶段成骨分化。（a）第4 天和 7 天CTS 下 β-肌动蛋白的蛋白质和 mRNA 表达。（b）CTS 和 RGDyk 组 CTS 下 β-肌动蛋白的蛋白和 mRNA 表达。（c）GM组、CTS组和RGDyk组在CTS作用下F-肌动蛋白的免疫荧光观察7天。
最后，研究探讨了循环牵张应力对细胞核 YAP 的影响机制。Western blotting 显示，循环牵张应力增加了核 YAP 的表达（图3 a）。整合素αVβ3 受到抑制后，RGDyk 组核 YAP 的表达低于 CTS 组（图3 b）。根据免疫荧光结果，GM 组染色的核内YAP蛋白呈模糊细胞核状轮廓。在循环牵张应力下，细胞核 YAP 蛋白呈高亮表达，轮廓清晰。在整合素αVβ3 被抑制后，RGDyk 组的核内 YAP 染色低于 CTS 组（图3 c）。以上结果表明，循环牵张应力通过整合素αVβ3 影响 YAP 核定位。
当细胞松弛素D 抑制 β-actin聚合时，细胞核 YAP 的表达在循环牵张应力下降低（图3 d）。此外，使用维替泊芬（Verteporfin）抑制核内YAP蛋白功能，western blotting显示YAP 核定位在牵张应力下降低。这些发现表明，促进肌动蛋白丝结构上的循环牵张应力可以增加 YAP 核定位，从而影响 MSCs 的早期成骨分化。
图3 整合素αVβ3 和肌动蛋白丝在 CTS 诱导的早期成骨分化中调节核 YAP 的表达。（a）CTS 下核 YAP 蛋白表达。（b）CTS 和 RGDyk 组 CTS 下核 YAP 的蛋白表达。（c）GM、CTS 和 RGDyk 组 CTS 下 YAP 免疫荧光。（d）GM 和 CytoD 组 CTS 下核 YAP 的蛋白表达。（e）GM 和 VP 组 CTS 下 ALP 和 RUNX2 的蛋白表达
总之，该研究表明，循环牵张应力通过激活整合素αVβ3 对 MSCs早期成骨分化产生积极影响，导致肌动蛋白丝的重排和黏着斑复合物的形成增加。此外，在循环牵张应力刺激下，肌动蛋白丝的重排通过整合素αVβ3 在人MSCs 中增加了YAP 核定位。因此，整合素αVβ3 和 YAP 核定位可参与 MSCs 的早期成骨分化。实验结果有助于对循环牵张应力诱导的人 MSCs 的早期成骨分化产生新的理解。
参考文献：Peng Y, Qu R, Yang Y, Fan T, Sun B, Khan AU, Wu S, Liu W, Zhu J, Chen J, Li X, Dai J, Ouyang J. Regulation of the integrin αVβ3- actin filaments axis in early osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells under cyclic tensile stress. Cell Commun Signal. 2023 Oct 30;21(1):308. doi: 10.1186/s12964-022-01027-7. PMID: 37904190; PMCID: PMC10614380.
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