Osteogenic Differentiation of Human Gingival Fibroblasts Inhibits Osteoclast Formation
Keywords: gingival fibroblasts; osteoblasts; osteoclastogenesis; osteoclasts; osteogenesis.
牙龈成纤维细胞（GFs）是牙龈组织中较丰富的细胞类型之一，它们通过产生细胞外基质（ECM）蛋白来调节和维持组织的完整性。它们还通过调节白细胞的细胞粘附、产生大量活性氧和诱导 T 细胞增殖来调节免疫和炎症反应。GFs 已被证明通过分泌白细胞介素-4（ IL-4）和骨保护素（OPG）来抑制破骨细胞分化，突出了其在健康个体中的骨骼保护能力。另一方面，GFs 能够在牙龈卟啉单胞菌等口腔病原体存在下诱导破骨细胞形成。一般来说，GFs 与周围细胞之间的这种串扰在指导牙周组织炎症反应的强度方面起着至关重要的作用。
此外，GFs 在分化成其他细胞类型（包括成骨细胞样细胞）的潜力方面显示出多功能性和可塑性。研究表明，分化成骨细胞样细胞的 GFs 高度表达成骨细胞相关基因。通过这种方式，GFs 有助于骨稳态。
由于这两个过程是否相互影响尚不清楚，因此，荷兰阿姆斯特丹大学和阿姆斯特丹自由大学联合牙科学术中心团队研究了 GFs 的成骨分化对其破骨细胞诱导能力的影响。具体地说，该研究探索了成骨分化状态（由矿化程度反映）如何影响 GFs 诱导破骨细胞前体分化为破骨细胞的能力。研究成果发表在 CELLS 期刊题为“Osteogenic Differentiation of Human Gingival Fibroblasts Inhibits Osteoclast Formation”。
首先，为了建立逐步矿化，将 GFs 分成四组培养3 周，在最后1周（min1）、2 周（min2）或全部3 周（min3）内使用或不使用成骨培养基，设置对照培养基组（C）。通过 ALP 活性、钙浓度、扫描电子显微镜（SEM）、茜素红染色和定量 PCR（qPCR）评估矿化情况。
在所有条件下培养 21 天后细胞数量增均有所加。在第21 天时，min3 条件下的细胞数量显著减少（图1 A）。在培养第 0 天和 21 天后测量 ALP 活性。与第 0 天相比，所有情况下的酶活性均显著增加，并在GFs暴露于成骨培养基中时间最长的 min3组中达到高水平（图1 B）。
然后，评估成骨分化的成纤维细胞的 Ca2+ 沉积能力，发现Ca2+ 浓度随着时间的推移显着增加，与其他条件相比，浓度在 min3 中最高（图1 C）。茜素红染色同样证实了这一点（图1 D）。
SEM 图像显示，随着时间的推移，矿化过程成功实现。随着长时间暴露于成骨培养基，矿物结节状结构的数量和大小从 C 组累积增加到 min3组（图1 E）。SEM 进一步揭示，初始矿物沉积（min1）通常在细胞顶部，而不是在沉积的基质上，在后期（min2 和 min3）更多地附着在基质结构上。
在第21天时测量早期成骨标志物 Runt 相关转录因子2（RUNX2）、基质蛋白 I 型胶原蛋白（COL1A1）和晚期成骨标志物骨连接素（Osteonectin）的基因表达水平，并没有观察到统计学上的显著差异（图1 F、G、H）。
总之，成骨结果表明，用成骨培养基培养长达 3 周会逐渐增加成骨参数，如钙沉积测定所反映的矿物质沉积。SEM 分析进一步显示，随着时间的推移，结节状结构增加。
图1 GFs 的成骨分化。
接下来，将 GFs 与含有破骨细胞前体的外周血单核细胞（PBMCs）共培养3 周，检测破骨细胞形成。TRAcP + 多核细胞的数量是衡量骨吸收和破骨细胞活性的重要指标，因此，在第42 天时计算具有三个或更多细胞核的 TRAcP + 多核细胞的数量（图2 A、B、C）。从对照组（C）到 min3 组，具有 3-5 个或超过 6 个细胞核的细胞数量显著减少（图2 B）。C 组和 min1 组破骨细胞形成最高，min3 组较低，其成骨培养基预培养时间最长（图2 B）。
在第 28 天（与PBMCs 共培养1 周）和 42天（与PBMCs 培养3 周）时测量 TRAcP 活性，发现不同时间点之间和不同条件之间没有显著差异，TRAcP 活性水平相似（图2 C）。
由于 TNF-α 即使在没有诱导破骨细胞分化的 RANKL 情况下也能刺激破骨细胞形成，因此，研究人员进一步评估了 TNF-α 的释放是否受矿化机制的影响。总体而言，TNF-α 分泌在第35天（与PBMCs 共培养2 周）显著高于第28天（与PBMCs共培养1 周）。在这两个时间点，长时间暴露于成骨培养基导致 TNF-α 分泌降低（图2 D）。
在第21 天和第35 天（添加 PBMCs 后 14 天）测量破骨细胞发生相关基因的表达，第21 天仅涉及共培养开始时 GFs 单一培养中的表达，第35 天反映了 GFs 和 PBMCs 的共培养中的表达。RANKL 在 min3 组的表达显著更高，表明长时间暴露于成骨培养基会增加 RANKL 表达，但在第35天时，两组间未观察到显著差异。此外，OPG 水平也在 min3 组最高，且在这两个时间点，OPG 水平都比 RANKL 高几倍。
图2 GFs的成骨分化抑制破骨细胞的形成。
破骨细胞形成的另一个重要分子是细胞间黏附分子-1（ICAM-1），它是 GFs 和 PBMCs 之间细胞间相互作用所必需的，第35 天时，min1 组的 ICAM-1 表达水平显著高于min3 组；巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）蛋白表达对破骨细胞前体的增殖至关重要，其同样在 min1 组中最高；基质金属蛋白酶（MMPs）通过控制细胞-基质相互作用和溶解骨基质对破骨细胞迁移很重要，然而，MMP-2 表达水平在任何时间点上都没有显著差异；转化生长因子β（TGF-β）可替代 RANKL，阻断其信号通路会抑制破骨细胞形成，在第21天时，TGF-β 表达水平在 min3 组最高；树突状细胞特异性跨膜蛋白（DC-STAMP）被认为是细胞间融合的重要基因，在第35天时，其在C组和min2组的表达存在显著差异；TRAcP 是破骨细胞活性的标志物，其在第35天时在整个条件下水平相似。
t-PA、u-PA 及其受体 u-PAR 等纤维蛋白溶解因子在骨代谢过程的调节中发挥作用。这些因子参与破骨细胞前体向破骨细胞的分化，调节成骨细胞对破骨细胞分化的诱导能力，并导致成骨细胞矿化细胞外基质。这些因素的变化会影响成骨细胞和破骨细胞的功能。为此，实验最后还研究了 t-PA、u-PA 及其受体 u-PAR 的基因表达水平，发现第21天时，t-PA、u-PA 及其受体 u-PAR 表达均在 min3 组最高。
图3 图形概要 GFs能够获得成骨表型，这导致破骨细胞形成减少。
这项研究描述了人类 GFs 的成骨分化对破骨细胞形成诱导能力的影响。研究首先表明 GFs 能够在成骨刺激下获得成骨表型。其次，在成骨培养基中培养时间越长，GFs 破骨细胞诱导能力就越弱。GFs 已被证明可以分化成成骨细胞样细胞，以结节形式发生钙沉积。它们的分化程度降低了它们诱导破骨细胞的能力。这进一步表明，通过适当的刺激，GFs 有可能用于再生牙周治疗。因此，未来的研究可能有助于确定调节分化过程及其对破骨细胞形成影响的确切机制和途径。
参考文献：Ceylan M, Schoenmaker T, Hogervorst JMA, Jansen IDC, Schimmel IM, Prins CM, Laine ML, de Vries TJ. Osteogenic Differentiation of Human Gingival Fibroblasts Inhibits Osteoclast Formation. Cells. 2024 Jun 24;13(13):1090. doi: 10.3390/cells13131090. PMID: 38994943; PMCID: PMC11240541.
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