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2024/12/25 11:37:48宠物通常被视为我们直系家庭中毛茸茸的(有鳞、有羽毛等)成员,在现代生活中扮演着重要角色。宠物用品从加热床到专业美容服务应有尽侑,因此它们的饮食受到更严格的审查也就不足为奇了。狗粮形式多样,不同食谱对健康有益也有风险。近来,无谷物或富含豆类的饮食因其与犬类心脏病——扩张型心肌病(DM)之间的联系而受到质疑,这种疾病可导致充血性心力衰竭,最终可能导致死亡。DM是由于缺乏牛磺酸引起的,因此狗的饮食必须含有足量的牛磺酸。
在本研究中,使用Discover Prep™系统水解狗粮样本,以将氨基酸从其结合的蛋白质中释放出来。与传统的水解技术相比,Discover Prep利用微波进行样本水解,将技术的时间框架从24小时缩短至不到一小时。水解后,样本被中和,并使用Waters AccQ-Tag®试剂盒测量氨基酸含量。结果表明,与传统方法相比,Discover Prep能够迅速且准确地从宠物食品中的蛋白质水解出牛磺酸,具有很好的精确度。无谷物狗粮和含谷物狗粮样本的牛磺酸含量进行了比较。对于实验室量化狗粮中的牛磺酸和其他氨基酸而言,Discover Prep是一个理想的选择。
二、材料与方法
试剂和样品
所有试剂均购自商业供应商。所有狗粮样品均从当地宠物用品店购买。所有狗粮样品均使用商用厨房搅拌机研磨。选择这些狗粮是因为它们的主要蛋白质成分不同,并且标称含有高含量的牛磺酸。分析了三个样品:样品1是三文鱼、红薯和南瓜配方,样品2是鸡肉和红薯配方,样品3是火鸡和燕麦配方。水解溶液在使用前新鲜制备。
狗粮样品使用CEM Discover Prep系统进行水解。通过柱前衍生化测定水解产物的氨基酸含量,然后通过UPLC®注射和在260 nm下的PDA检测进行分析。使用Waters AccQ-Tag Ultra衍生化试剂盒对水解产物进行LC-PDA分析。Discover Prep样品制备的结果与传统烤箱法及营养标签进行了比较。
Discover Prep样品制备
将100毫克狗粮样品加入装有搅拌棒的35 mL Discover Pyrex®小瓶中。记录质量以供分析。对于酸性水解,向每个小瓶中加入5毫升含1%苯酚的6 N HCl。所有小瓶用N2吹扫1分钟,然后迅速盖上盖子。样品按以下Discover Prep方法运行:
酸性水解
小瓶类型:Pyrex
控制类型:动态
温度:160 °C
时间:30分钟
压力:300 PSI
功率:300 W
搅拌:高
传统水解样品制备
将40毫克狗粮样品加入适当的玻璃小瓶中。记录质量以供分析。对于酸性水解,向每个小瓶中加入2毫升含1%苯酚的6 N HCl。所有小瓶用N2吹扫1分钟,然后迅速盖上盖子。然后将小瓶放入设定为110 °C的空气烘箱中24小时。
水解后样品制备和衍生化分析
酸性水解样品用6 N NaOH中和,并用0.26 µm PTFE注射器过滤器过滤。中和后,样品用Waters AccQ-Tag试剂盒进行衍生化。向一个完整的回收小瓶中加入80 µL来自Waters AccQ-Tag Ultra衍生化试剂盒的硼酸缓冲液。然后,加入10 µL样品并盖紧盖子涡旋。接着,向每个样品反应中加入10 µL准备好的衍生化试剂。最后,将反应涡旋10秒钟,然后在55 °C下加热10分钟进行分析。
分析
每个衍生化反应取1 μL样品注入Waters AccQ-Tag Ultra C18柱(1.7 μm, 2.1 x 100 mm),该柱连接到带有Waters PDA检测器的Waters ACQUITY™ H-Class UPLC®。流速设定为0.4 mL/min。柱温保持在55 °C,吸收波长监测在260 nm。用于分离的洗脱梯度如表1所示。流动相为A: Milli-Q®水中稀释10倍的Waters AccQ-Tag洗脱液A和B: Waters AccQ-Tag洗脱液B。为了每种氨基酸创建校准曲线,使用Waters Amino Acid Food and Feed Standard Kit(Waters Corporation, SKU. 186009299)进行衍生化,浓度分别为1, 5, 10, 25, 和50 pmol/μL。采用线性回归法分析样品。
表1. 衍生化氨基酸分离所用梯度
图1. Discover Prep水解中回收的牛磺酸量
图2. 从狗粮中回收的氨基酸量
Discover Prep微波反应系统成功水解了宠物食品中的氨基酸,并产生了与传统烘箱水解相似的结果。在比较氨基酸含量时,传统烘箱水解和Discover水解的结果%RSD均小于10%。在比较狗粮的牛磺酸含量时,样品1的含量最高,其次是样品2和样品3。