图 1. Co-IP 原理图。
X：诱饵蛋白，Z：靶标蛋白
简单来说，就是利用抗体捕捉目标蛋白，看看有哪些其他蛋白会“搭顺风车”来到沉淀派对。这样我们就可以知道哪些蛋白质在细胞内是好朋友，经常一起 Hang out！
可沉淀诱饵蛋白在天然组织细胞状态下存在互作关系的所有蛋白；
可沉淀整个复合体中直接/间接互作的多个蛋白，研究复合体组成；
可与质谱鉴定连用可以初筛到一系列未知蛋白，再通过其他技术进一步验证；
分离得到天然状态下相互作用的蛋白质复合体，结果更真实可靠。
Co-IP 分类
在众多 Co-IP 分类方式中，内源性和外源性 Co-IP 就像科研界的双子星，不仅最-常用，还各自闪耀独-特的光芒！
小贴士：
内源性 Co-IP：研究细胞或组织中自然表达的蛋白质。
外源性 Co-IP：研究经过转染介导的外源表达系统来表达的蛋白质。
Co-IP 实验流程
图 2. Co-IP 实验流程图[1][5]。
采用适当的方法收集细胞，使用含有合适的蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液裂解细胞。
将含有保护液的蛋白 A/G 磁珠或蛋白 A/G 琼脂糖混匀取出，用平衡液清洗磁珠/琼脂糖凝胶。
将细胞裂解液或已预处理的样本用蛋白 A/G 磁珠或蛋白 A/G 琼脂糖进行预清洗，去除非特异性结合的蛋白质。
预清洗的样本中加入诱饵蛋白的特异性抗体，孵育促进抗体与蛋白结合。加入蛋白 A/G 磁珠或蛋白 A/G 琼脂糖继续孵育使其与复合物结合。
洗涤复合物，去除非特异性结合蛋白。
加入洗脱缓冲液，洗脱。
Western Blot 或质谱检测分析沉淀的诱饵蛋白及与其结合的靶标蛋白。
Co-IP 结果解读
随着 Co-IP 实验流程的完成，我们终于手握初步数据！那么，这些数据能告诉我们什么秘密？结果出来了，肿么分析呢？
以下让小 M 通过两个经典案例，来看看如何解读实验结果，挖掘蛋白质相互作用的“朋友圈”！
图 3. 内源性 ANT2 和 GRP75之间存在相互作用[6]。
图 4. 外源 GRP75 可增强 ANT2-UCP1 的相互作用[6]。
避坑指南：如何高效无误地进行 Co-IP?
样品准备：打好地基
关注点 | 说明 |
裂解液 | 温和的非离子型洗涤剂 (如 NP-40、Triton X-100) 可以保护蛋白的天然结构，同时避免过强的去污剂 (如 SDS) 破坏蛋白相互作用。 MCE 裂解液推荐：WB/IP 裂解液、NP-40 裂解液、哺乳动物活性蛋白抽提试剂。 |
盐浓度 | 样品准备时体系中的盐浓度范围在 150 - 300 mM 即可，过高可能“拆散”蛋白关系，过低可能导致背景蛋白“搅局”。 |
蛋白酶抑制剂 | 适当加入蛋白酶抑制剂，保护“核心成员”防止其被细胞内源性蛋白酶降解。 MCE 蛋白酶抑制剂推荐：蛋白酶抑制剂 Cocktail、蛋白酶抑制剂 Cocktail, 片剂。 |
结构干扰 | 提前查阅文献了解蛋白“爱好”，重视蛋白修饰，如磷酸化、乙酰化等是否会影响复合物的稳定性。 |
表达水平 | 提前验证目标蛋白表达水平，表达低可考虑优化转染或表达条件。 |
温度 | 低温环境下制备样品，防止蛋白“跑路”。 |
抗体选择：定向输出
无论是拉下目标蛋白还是背景干扰，抗体都能“一锤定音”。
关注点 | 说明 |
抗体专一性 | 选择经过 IP 验证的抗体，不可盲选。 MCE 标签抗体：DYKDDDDK Tag (FLAG) 抗体、HA tag 抗体 (YA856)、Myc-tag 抗体。 |
同型对照 | 根据 IP 抗体类型选择合适的同型对照抗体。 MCE 同型对照抗体推荐：Rabbit IgG Isotype Control、Mouse IgG Isotype Control。 |
抗体来源 | 一抗和二抗的宿主种属要避开“同宗”，否则背景会抢戏。 |
抗体测试 | 必要时进行预实验封闭抗体测试，验证磁珠/琼脂糖珠可与抗体有效结合。 |
抗体用量 | 太多可能造成非特异性沉淀，太少又可能拉不住目标蛋白。建议从优化实验中找到合适的浓度和用量。 |
二抗选择 | 如果抗体重链和目标蛋白大小相近，可选择轻链特异性二抗避免“撞车”。 |
实验设计：精准操作
实验环节 | 说明 |
实验设计 | 确定研究的蛋白质对，不胡乱邀请“不相干”的蛋白。 |
对照组设计 | 实验组、IgG 阴性组、阳性组 (Input)。 |
洗涤条件 | 适当调整洗涤强度 (如低盐到高盐、去垢剂浓度等)，既要去除非特异性蛋白，又要保护靶蛋白复合物。 |
Western Blot | 用 Western Blot来做最后的“身份确认”，确保邀请到的都是真正的“贵宾”。 |
如何让你的 Co-IP 实验更上一层楼？
每次实验的具体条件、操作步骤记得详细记录，这样才能在出现问题时找到原因，不断优化喔~
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HA 标签蛋白 IP，外源性 Co-IP 实验 |
IP、内源性 Co-IP 实验 |
Flag 标签蛋白 IP，外源性 Co-IP 实验 |
兔 IgG 阴性对照 |
鼠 IgG 阴性对照 |
参考文献：
