Mechanical force induces macrophage-derived exosomal UCHL3 promoting bone marrow mesenchymal stem cell osteogenesis by targeting SMAD1
Keywords: Exosomes; Macrophages; Mechanical force; Orthodontic tooth movement; Osteogenesis; SMAD1; UCHL3.
正畸牙齿移动（OTM）是由机械力诱导的牙槽骨重塑过程，并受局部无菌炎症的调节，其潜在机制对解剖至关重要。巨噬细胞作为机械敏感细胞，通过分泌细胞因子和调节局部炎症在 OTM 中起着至关重要的作用。研究证明，骨髓来源的间充质干细胞（BMSCs）具有显著的自我更新能力和多向分化潜能，是成骨细胞的前体细胞，可以直接响应机械力并促进 OTM 期间牙槽骨的形成。因此，在机械力下巨噬细胞与BMSCs的相互串扰以促进其成骨的过程可能是 OTM 期间机械力诱导牙槽骨形成的重要组成部分。
越来越多的证据表明，外泌体在骨重塑微环境中介导了巨噬细胞和 BMSCs 之间的通讯。外泌体的双层膜结构能很好的保护其包被的物质，如核酸、蛋白质和脂质等。此外，外泌体可以直接被 BMSCs 内吞，而不是被某些反馈机制（如细胞因子）抑制。然而，在机械力作用下，来自巨噬细胞的外泌体是否以及如何调节 BMSCs 成骨以及牙槽骨形成仍然未知。
基于此，南京医科大学附属口腔医院口腔正畸科及江苏省心血管病转化医学协同创新中心的研究团队进行了深入探索，表明了机械力调节骨髓来源的巨噬细胞（BMDM）分泌的外泌体泛素羧基末端水解酶同工酶L3（UCHL3），它通过靶向Smad同源物1（SMAD1）促进 BMSCs 成骨，从而促进 OTM 期间牙槽骨形成。研究成果发布于 Journal of Nanobiotechnology 期刊题为“Mechanical force induces macrophage-derived exosomal UCHL3 promoting bone marrow mesenchymal stem cell osteogenesis by targeting SMAD1”。
首先，为了模拟体外 OTM 期间的 BMSCs 成骨，构建机械力反应培养系统，其中 BMDMs 用暴露于不同的机械刺激（MS），然后收集其上清液来处理 BMSCs（图1 a）。通过 CCK-8 分析测定 BMDMs 在不同应变水平（0.5Hz，0、5、10、15%）或持续时间（0、2、6 、10 h）影响下的活力，发现无论时间如何变化，10% 应变水平下其细胞活力显著增加，因此将其作为进一步实验的标准应变幅度。
qRT-PCR、WB及ALP 染色显示，与其他组相比，MS（10%，6 h）-BMDMs衍生的条件培养基显著增加了 BMSCs 中成骨基因（Alp、Runx2 Col1 和 Ocn）（图1 b-e）、成骨转录因子RUNX2 （图1 f、g）、ALP 水平的表达（图1 h），且细胞外基质矿化沉积增强（图1 i）。这些结果证实了适度的机械力促进了 BMDM-介导的 BMSC 成骨。
随后，探索可能在 MS-BMDMs 上清液中介导 BMSCs 成骨的参与者，并将重点放在外泌体上。TEM显示，这些纯化的囊泡具有杯状或球形形态（图1 J），直径主要在 30-200 nm 之间（图1 k）。WB 进一步证实，这些颗粒上存在 CD63 和 TSG101 等外泌体表面标志物（图1 l）。此外，MS-BMDMs 的上清液具有比 BMDMs 更多的外泌体（图1 m）。这些数据表明，这些纳米颗粒是外泌体，机械力促进了 BMDMs 衍生的外泌体的分泌。基于这些发现，可以推测外泌体可能是 MS-BMDMs 分泌的影响 BMSCs 成骨的关键介质。
为了证实源自 MS-BMDMs 的外泌体在介导 BMSCs 成骨中的潜在作用，用荧光染料 Dil 标记 MS-BENDM-EXOs，并用这些外泌体处理 BMSCs 12 h，发现MS-BMDM-EXOs 显著促进了成骨基因的 mRNA 表达和 RUNX2 蛋白水平、ALP 水平和细胞外基质矿化沉积。这表明，来自 MS-BMDMs 的外泌体促进 BMSCs 中的成骨。
图1 机械力促进 BMDM 介导的 BMSCs 成骨。
接下来，为了探索 MS-BMDMs 衍生的外泌体在 OTM 期间牙槽骨形成中的作用，建立了小鼠 OTM 模型，并注射 GW4869（外泌体分泌抑制剂）。压缩力（10 g）作用 14 天后，GW4869 显著抑制了牙齿移动，牙槽骨骨体积分数（BV/TV）显著降低，张力侧的 ALP 阳性表面受到抑制，从而表明抑制外泌体会损害 OTM 期间牙槽骨的形成。局部注射PBS、BMDM-EXOs 和 MS-BMDM-EXOs 到负荷牙齿中，14 天后，发现BMDM-EXOs 处理大大提高了负荷牙齿牙槽骨的 BV/TV，并且 MS-BMDM-EXOs 进一步增强了这种效果。ALP 染色结果呈现相同的效应。这些结果表明，来自 MS-BMDMs 的外泌体促进了牙齿移动过程中牙槽骨的形成。
进一步地，通过蛋白质组学分析 MS-BMDM-EXOs 和 BMDM-EXOs 中的蛋白表达谱。在 MS-BMDM-EXOs 组的上调蛋白中，发现了UCHL3的富集，其参与细胞蛋白质修饰过程。WB结果进一步揭示，BMDMs 中的 UCHL3 蛋白水平高于 BMSCs，机械力增加了 BMDMs 和 BMDM-EXOs 中 UCHL3 的蛋白水平。因此，UCHL3 可能是 MS-BMDM-EXOs 中最重要的因子之一。
使用 TCID（UCHL3 抑制剂）处理 BMSCs，发现其显著降低了成骨基因、RUNX2 蛋白（图2 a-c）及ALP 表达水平和细胞外基质的矿化沉积（图2 d、e）。这表明，UCHL3 对 BMSCs 的成骨至关重要。然后，使用 siUchl3 敲低 MS-BMDMs 中 Uchl3 的表达（图2 f、g），MS-BMDMsiUchl3-EXOs 中 UCHL3 蛋白水平得到有效抑制（图2 h），然后用 MS-BMDMsiCon-EXOs 和 MS-BMDMsiUchl3-EXOs 处理 BMSCs。结果显示，与对照组相比，MS-BMDM-EXOs 中 UCHL3 下调后，BMSCs 中成骨基因、RUNX2 蛋白水平显著下调（2 i-k），ALP 水平和细胞外基质矿化沉积也受损（图2 l、m）。这些结果表明，UCHL3 是 MS-BMDM-EXO 介导的 BMSC 成骨所必需的。
为了确定UCHL3 在 OTM 期间介导牙槽骨形成中的作用，建立OTM 模型，并在负荷期间注射UCHL3 抑制剂 TCID 。压缩负荷14 天，TCID 注射后牙齿移动距离明显减小，牙槽骨BV/TV显著降低，张力侧的 ALP 阳性表面受到抑制。此外，siUchl3 敲低 MS-BMDM-EXOs 中的 UCHL3 表达后，负荷牙槽骨的 BV/TV 同样降低，ALP 阳性表面也显著受损。这些结果表明，OTM 期间 MS-BMDM-EXO 介导的牙槽骨形成需要 UCHL3。
图2 UCHL3 是 MS-BMDM-EXO 介导的体外 BMSC 成骨所必需的。
最后，实验探讨了 MS-BMDM 衍生的外泌体 UCHL3 调节 BMSCs 成骨的机制。据报道，UCHL3 可以与 SMAD1 相互作用，SMAD1 是一种参与 BMSC 成骨的经典相关分子。因此，研究人员假设UCHL3 可以通过调节 SMAD1 介导 BMSC 成骨。为了验证 UCHL3 和 SMAD1 之间的相关性，使用 TCID 和 MS-BMDMsiUchl3-EXOs 处理 BMSCs，发现当 UCHL3 被敲低时，SMAD1 的蛋白水平下调（图3 a-c）。然后，在BMSCs中过表达 SMAD1，发现其显著逆转了 MS-BMDM-EXOs 中 UCHL3 抑制引起的成骨基因表达、RUNX2 蛋白（图3 d-f）、ALP 水平和细胞外基质矿化沉积的下调（图3 g、h）。
那么，UCHL3 如何调节 BMSCs 中 SMAD1 的功能？Alphafold 2 的蛋白质对接结果显示，UCHL3 可以通过氢键直接与 SMAD1 结合（图3 i）。进一步的免疫荧光和免疫共沉淀验证了 BMSCs 中 UCHL3 和 SMAD1 之间的相互作用（图3 j-l）。此外，TCID 对内源性UCHL3 的抑制提高了 BMSCs 中内源性 SMAD1 的泛素化水平（图3 m），这表明 UCHL3 可以通过去泛素化提高 SMAD1 蛋白的稳定性。同时，免疫组化染色实验显示，UCHL3 抑制剂 TCID 降低了牙齿移动小鼠负荷牙槽骨中的 SMAD1 水平。这些结果表明，SMAD1 是 MS-BMDM-EXO 衍生的 UCHL3 促进 BMSCs 成骨所必需的。
图3 MS-BMDM 衍生的外泌体 UCHL3 通过靶向 SMAD1 促进 BMSCs 成骨。
图4 图形概要
研究表明，机械力诱导的巨噬细胞衍生的外泌体 UCHL3 通过靶向 SMAD1 促进 BMSCs 成骨，从而促进 OTM 期间牙槽骨的形成。
总之，该研究表明，机械力可以改变巨噬细胞衍生的外泌体中的蛋白质组成。外泌体将 UCHL3 从机械刺激的巨噬细胞转移到 BMSCs，提高了 BMSCs 中的 SMAD1 水平，这有利于 BMSCs 成骨，从而促进 OTM 期间牙槽骨的形成。因此，这些发现从巨噬细胞衍生的外泌体调节 BMSCs 成骨的角度证明了 OTM 过程中机械力诱导成骨的机制，这可能有助于开发正畸治疗临床问题的新解决方案。
参考文献：Pu P, Wu S, Zhang K, Xu H, Guan J, Jin Z, Sun W, Zhang H, Yan B. Mechanical force induces macrophage-derived exosomal UCHL3 promoting bone marrow mesenchymal stem cell osteogenesis by targeting SMAD1. J Nanobiotechnology. 2023 Mar 14;21(1):88. doi: 10.1186/s12951-023-01836-z. PMID: 36915132; PMCID: PMC10012474.
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