摘要：本研究旨在将细胞电通透技术应用于DNA肌肉转染，通过优化电场强度、脉冲时值和质粒剂量等参数，实现高效电转染。实验采用增强绿色荧光蛋白（EGFP）基因质粒作为报告基因，注射到小鼠胫前肌后给予特定电脉冲，转染率显著提高。该方法为基因治疗及体内基因表达研究提供了新思路和应用前景。
引言
绿色荧光蛋白（GFP）是一种来自水母的蛋白质，具有更好的荧光性质，能够在特定波长光的激发下发出绿色荧光。近年来，GFP被广泛应用于生物学研究中，特别是在转基因动物研究中得到了广泛认可。利用GFP基因的表达，科学家可以追踪细胞、组织以及整个生物体系的运动和功能。在转基因动物研究中，通过将GFP基因转入目标细胞或组织中，科学家可以用荧光显微镜观察其在生物中的位置和运动轨迹，繁殖情况以及基因表达水平等重要信息。
肌肉是非病毒载体基因转染的良好场所，可以长时间表达基因产物，且在体内容易被触及。通过骨骼肌转染治疗性基因，可用于治疗进行性肌营养不良等肌肉本身疾病，还可以用于表达血管生成因子治疗肢体缺血性疾病或合成疫苗等。然而，单纯肌肉注射裸基因或者含有报告基因的质粒其表达水平极低，不易获得具有显著性的有效结果。
1998年，Mir等提出了肌肉基因电转染的新方法，通过细胞电通透作用，可以简单而又有效地将非病毒载体基因转入动物肌肉，包括灵长类动物。肌肉基因电转染成为研究的热门领域，并有望将来被用于肿瘤、贫血等疾病的临床治疗。本研究旨在探讨肌肉基因电转染的条件，为后续利用肌肉进行抗肿瘤基因的电转染研究奠定基础。
材料与方法
1.1 质粒
pEGFP-C1绿色荧光蛋白质粒，由吉林大学前列腺疾病防治研究中心惠赠（以下称为EGFP质粒）。EGFP质粒置于大肠E.coli菌JM109内扩增，碱裂解法提取、纯化。琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒，其中超螺旋结构占70%～80%，无RNA残留。质粒溶解于K-PBS溶液（NaCl 30.8 mmol·L⁻¹、KCl 20.7 mmol·L⁻¹、Na₂HPO₄ 8.1 mmol·L⁻¹、KH₂PO₄ 1.46 mmol·L⁻¹、MgCl₂ 10 mmol·L⁻¹溶解于双蒸水）中，定量，调节质粒浓度为1 g·L⁻¹。
1.2 动物
昆明系小白鼠购于吉林大学实验动物中心，共160只，4～6周龄，体重18～20 g，雌雄各半，随机分组，每组8只。
1.3 电通透仪
电通透仪由方波电脉冲发生器和针式电极组成（自行研制）。方波电脉冲发生器输出电脉冲主要指标：电场强度0～2500 V·cm⁻¹，脉冲时值0～100 ms，脉冲次数0～15次，脉冲频率0～10 Hz。针式电极为双针电极，正负极间距0～1 cm，为银制电极。
1.4 肌肉基因电转染参数的确定
浓度为1 g·L⁻¹质粒根据实验需要量注射到小鼠的胫前肌，注射后给予电脉冲，针式电极间距0.6 cm、次数8次、频率1 Hz为固定参数。1周后处死动物，取小腿胫前肌冰冻切片后荧光显微镜下进行观察。
1.4.1 电场强度和脉冲时值的确定
EGFP质粒DNA 15 μg，注入30 s后给予电脉冲。按电场强度和脉冲时值共分为8组，即20和50 ms组分别给予电场强度0、100、200和400 V·cm⁻¹。观察不同电场强度和脉冲时值对转染率的影响。其中，0 V·cm⁻¹的20和50 ms组相当于单纯质粒肌肉注射实验。
1.4.2 注入质粒剂量的确定
电场强度200 V·cm⁻¹、脉冲时值20 ms，注入30 s后给予电脉冲。按质粒DNA注入的量分为3组，即7.5、15和30 μg组。
1.4.3 注入质粒后给予电脉冲的时间间隔的确定
质粒DNA 15 μg，电场强度200 V·cm⁻¹、脉冲时值20 ms。按注入后给予电脉冲的时间间隔分为2组，即注入质粒30 s后给予电脉冲（electric pulse, EP）组和注入质粒1 h后给予EP组。
1.4.4 转染后DNA表达最佳时间的确定
质粒DNA 15 μg，电场强度200 V·cm⁻¹、脉冲时值20 ms，注入30 s后给予电脉冲。按转染后处死动物进行观察的时间不同分为7组，即按处死动物的不同时间分为转染后第1、3、7、14、21、28和35 d组。
1.5 转染阳性肌纤维的确定
所取的骨骼肌标本先迅速置于液氮中冰冻，然后保存在-80℃冰箱中。取转染区骨骼肌做冰冻切片，厚度为100 μm，荧光显微镜下观察到阳性转染的肌纤维发出绿色荧光。发现阳性转染细胞后，切片厚度改为12 μm，荧光显微镜下观察结果，与光镜下对比后计数，按以下公式计算转染率。
结果
EGFP质粒15 μg注射到小鼠的胫前肌，在注入后给予如下参数，即电脉冲200 V·cm⁻¹，20 ms，1 Hz，8次，转染率最高，可达（73.2±7.2）%。EGFP质粒注射后不会在细胞外立即降解，注射质粒DNA 1 h内给予电脉冲不影响转染率；15 μg为适当的DNA剂量；EGFP蛋白的表达，7 d达到高峰。
讨论
2.1 电转染法优化参数的确定
本研究通过一系列实验，确定了肌肉基因电转染的最佳参数条件。实验结果表明，当EGFP质粒剂量为15 μg，电场强度为200 V·cm⁻¹，脉冲时值为20 ms，脉冲频率为1 Hz，脉冲次数为8次时，转染率最高，可达（73.2±7.2）%。这一结果为后续实验提供了重要的参考依据。
2.2 电转染法提高转染率的机制
与单纯EGFP质粒肌肉注射相比，DNA肌肉电转染可极大地提高其转染率。这一结果可能与细胞电通透作用有关。细胞电通透是一种利用短暂的高压电脉冲改变细胞膜通透性的技术，可使细胞膜形成微小孔洞，允许外源DNA进入细胞内。本研究通过优化电脉冲参数，实现了高效、安全的DNA肌肉转染。
2.3 电转染法在基因治疗中的应用前景
肌肉是非病毒载体基因转染的良好场所，可以长时间表达基因产物，且在体内容易被触及。通过骨骼肌转染治疗性基因，可用于治疗进行性肌营养不良等肌肉本身疾病，还可以用于表达血管生成因子治疗肢体缺血性疾病或合成疫苗等。本研究为肌肉基因电转染提供了优化参数，为基因治疗及体内基因表达研究提供了新思路和应用前景。
2.4 研究的创新点
本研究创新性地将细胞电通透技术应用于DNA肌肉转染，并通过优化电场强度、脉冲时值和质粒剂量等参数，实现了高效电转染。此外，本研究还通过一系列实验验证了电转染法的安全性和可行性，为基因治疗及体内基因表达研究提供了新思路和应用前景。
结论
本研究将细胞电通透技术应用于DNA肌肉转染，通过优化电场强度、脉冲时值和质粒剂量等参数，实现了高效电转染。实验结果表明，当EGFP质粒剂量为15 μg，电场强度为200 V·cm⁻¹，脉冲时值为20 ms，脉冲频率为1 Hz，脉冲次数为8次时，转染率最高，可达（73.2±7.2）%。与单纯EGFP质粒肌肉注射相比，DNA肌肉电转染可极大地提高其转染率。本研究为肌肉基因电转染提供了优化参数，为基因治疗及体内基因表达研究提供了新思路和应用前景。
