上海允麦生物科技有限公司
2012/6/6 12:16:06 从免疫血清纯化抗体
1． 剪取一小条0.45 μm 的硝酸纤维膜，置于1.5ml eppendorf 管中，浸没于1 ml
1 mg/ml 的抗原溶液中，5 min。
2． 取出膜，置于滤纸上干燥。
3． 将膜放置于装有1 ml Buffer A 的eppendorf 管，轻轻震荡混匀30 min。
4． 移去Buffer A，用新鲜的Buffer A 洗一次，将膜浸没于0.8-1 ml 相应的抗血
清中，1-2 h, 于混匀器上轻轻震荡混匀。
5． 移去血清，用PBS 洗膜，4 次，每次5 min。
6． 洗脱抗体
新配置100 mM 甘氨酸（pH 2.5）抗体洗脱液，将膜置于洗液中，手轻摇
混匀2 min，迅速将洗液转移至装有100 μl 1 M Tris（pH 8.0）中和，使抗体
复性。第1 次洗脱用400 μl 抗体洗脱液，第2，3 次用200 μl。
7． 往洗脱下来的液体中加入100 μl Buffer A 以稳定抗体，并分装成30 μl 每管，
于-20℃保存。
注：所有步骤均在室温完成。
精制免疫球蛋白的方法很多。一般采用综合技术，避免蛋白变性。如分离IgG时，多结合使
用盐析法与离子交换法，以求纯化。提取IgM的方法也很多，如应用凝胶过滤与制备电泳法，或离子交换与凝胶过滤等。
一、盐析法
取x ml血清加x ml生理盐水，于搅拌下逐滴加入2xml饱和硫酸铵，硫酸铵的终饱和度为50%。
↓4℃，3h以上，使其充分沉淀离心（3000rpm）,20min,充上清，以xml生理盐水溶解沉淀，再逐滴加饱和硫酸铵x/2ml。
↓置4℃3h以上，[此时，（NH4）2SO4的饱和度为33%]重复上述第二步过程1～2次。末次离心后所得沉淀物为γ-球蛋白，以0.02%mol/L pH7.4PBS溶解至xml装入透析袋。
↓对PBS充分透析、换液3次，至萘氏试剂测透析外液无黄色，即无NH4+为止。
取透析袋内样品少许作适当倍数稀释后，以751型紫外分光光度计测定蛋白含量。
影响盐析的因素很多，如蛋白质的浓度，盐的浓度，饱和度和pH，温度等都可影响盐析的结果，操作时要充分注意（参阅本章 第二节 ）。
二、冷酒精沉淀法
分离过程如下。血清加3倍体积的蒸馏水，调节 pH至7.7（±）冷却到0℃。在激烈搅拌的条件下，加预冷的酒精（-20℃）到zui终浓度为20%，保持在-5℃。产生的沉淀（A），含有大多数种类的免疫球蛋白。沉淀A悬浮于25倍体积的0.15～20mol/L NaCl溶液（冷）中，加有0.05mol/L醋酸调节 pH到5.1，产生的沉淀（B），包括大部分的IgA和IgM，IgG留在上清液内。调节 上清液的pH到7.4，加冷酒精（-20℃～-30℃）到zui终浓度为25%，维持在-5℃。所得到的沉淀（C）含有90%～98%IgG。不同动物，IgG分离的条件和产量略有不同。见表2-5。从沉淀（B）可按下述方法进一步分离出IgA和IgM的混合物：将沉淀（B）悬浮在0℃ 水中，调节 pH到5.1，离心去除不溶的蛋白。调节 上清液离子强度到0.01～0.0075,pH5.5。然后加冷酒精到zui终浓度为10%，保持在–2℃或-3℃低温，所得的沉淀（B-B）主要含IgA和IgM。
表2-5 从几种动物和人血清沉淀A分离IgM的条件
物 种 pH 沉淀条件 IgG产量
酒精浓度（%） 离子强度
人 5.1 15. 0.01 65
山羊 5.2 0 0.01 65
家兔 5.2 10 0.01 70
大鼠 5.0 15 0.01 50
豚鼠 5.1 15 0.01 70
三、DEAE-Sephadex A-50 柱层析纯化免疫球蛋白
原理：DEAE-Sephadex A-50（二乙氨基—乙基-葡萄糖凝胶A-50）为弱碱性阳离子交换剂。用NaOH将Cl-型转变为OH-型后，可吸附酸性蛋白。血清中的γ球蛋白属于中性蛋白（等电点为pH6.85～7.5），其余均属酸性蛋白。PH7.2～7.4的环境中，酸性蛋白均被DEAE- Sephadex A-50吸附，只有γ球蛋白不被吸附。因此，通过柱层析，γ球蛋白便可在洗脱中先流出，而其他蛋白则被吸附在柱上，从而便可分离获得纯化的IgG.
（一）操作步骤
1．DEAE-Sephadex
A-50预处理 称DEAE-SephadexA-50（下称A-50）5g，悬于500ml蒸馏水内，1h后倾去上层细粒。按每克A-50加0.5mol/LNaOH 15ml的比例，将A-50浸泡于0.5mol/LNaOH液中，搅匀，静置30min，装入布氏漏斗（垫有2层滤纸）中抽滤，并反复用蒸馏水抽洗至pH呈中性；再以0.5mol/LHCl同上操作过程处理，zui后以0.5mol/LNaOH 再处理一次。处理完后，将A-50浸泡于0.1mol/LpH7.4PB中过夜 。
2．装柱
（1）将层析柱垂直固定于滴定架上，柱底垫一圆形尼龙纱，出水口接一乳胶或塑料管并关闭开关。
（2）将0.1mol/L,pH7.4PB沿玻璃棒倒入柱中至1/4高度，再倒入经预处理并以同上缓冲液调成稀糊状的A-50。等A-50。等A-50凝胶沉降2～3cm高时，开启出水口螺旋夹，控制流速1ml/min，同时连续倒入糊状A-50凝胶至所需高度。
（3）关闭出水口，待A-50凝胶*沉降后，柱面放一圆形滤纸片，以橡皮塞塞紧柱上口。通过插入橡皮塞之针头及所连接的乳胶或塑料管与洗脱液瓶相连接。
3．平衡
启开出水口螺旋夹，控制流速12～14滴/min。使约2倍床体积的洗脱液流出。并以pH计与电导仪分别测定洗脱液及流出液之pH值与离子强度，两者达到一致时关闭出水口，停止平衡。
4．加样及洗脱
启开上口橡皮塞入下口螺旋夹，使柱中液体缓慢滴出，当柱面液体与柱面相切时，立即关闭出水口，以毛细滴管沿柱壁加入样品（体积应<床体积2%，蛋白浓度以<100mg为宜）。松开出水口螺旋夹使面样品缓慢进入柱内，至与柱面相切时，立即关闭下口，以少量洗脱液洗柱壁2～3次；再放开出水口，使洗液进入床柱，随后立即于柱面上加入数毫升洗脱液，紧塞柱上口，使整个洗脱过程成一密闭系统。并控制流速12～14滴/min。
5．收集
开始洗脱的同时就以试管进行收集。每管收集3～5ml。共收集10～15管。
6．测蛋白
以751型紫外分光光度计分别测定每管OD280nm, 与OD260nm,按公式计算各管蛋白含量 。并以OD280nm为纵座标，以试管编号为横座标，绘制洗脱曲线。
7．合并、浓缩
将洗锐峰的上坡段与下坡段各管收集液分别进行合并，以PEG（MW6000）浓缩至所需体积，加入0.02%NaN3防腐，于4℃保存备用。长期保存时应贮于-40℃冰箱。
8．A-50凝胶的再生
在柱上先以2mol/LNaCl洗脱蛋白至流出液的OD280nm<0.02，再以蒸馏水洗去柱中盐。然后按预处理过程将A-50再处理一遍即达到再生。近期用时泡于洗脱缓冲液中4℃保存；近期不用时，以*洗2次，再置50℃温箱烘干，装瓶内保存。
（二）注意事项
（1）柱的选择：从理论上说，只要柱足够长，就能获得理想的分辨率，但由于层析柱流速同压力梯度有关，柱长增加使流速减慢，峰变宽，分辨率降低。柱的直径增加，使流体流动的不均匀性增加，分辨率明显下降。
（2）纯化过程必须严格控制缓冲液的pH及离子强度。样品与A-50凝胶必须用洗脱缓冲液*平衡后，才能进行柱层析。
（3）所装的柱床必须表面平整，无沟流及气泡，否则应重装。
（4）洗脱过程中应严格控制流速，切勿过快。
（5）上样的体积要小，浓度不宜过高。
（6）加样及整个洗脱过程中，严防柱面变干。
四、SPA-Sepharose CL-4B 亲合层析纯化
IgG及IgG亚类
（一）原理
葡萄球菌A蛋白（SPA）具有与多种哺乳动物IgG分子Fc段结合的能力，并与不同IgG亚类的结合力有所差别。改变pH及离子强度可洗脱结合于SPA-SepharoseCL-4B 柱上的IgG或不同的IgG 亚类，可直接纯化血清或小鼠腹水中的IgG抗体。
（二）操作步骤
用0.1mol/L pH8.0磷酸缓冲液浸泡SPA-SepharoseCL-4B凝胶，15min。按1g干胶200ml上述缓冲液充分洗涤凝胶，（用玻璃漏斗过滤或置烧杯中洗涤）。
↓
装柱后用0.1mol/L pH8.0磷酸缓冲液平衡。标本可用硫酸铵粗提物，先10000g离心除去杂质，必要时用0.22μm滤膜过滤，上样前用1mol/L pH9.0 Tris 液调整标本液pH至8.1或对平衡液透析过夜。
↓
加样，一般按25～30mg IgG/g湿胶比例加样，室温作用15min，用0.1mol/LpH8.0磷酸缓冲液充分淋洗，到淋洗液OD值为<0.02。
↓
用不同pH的枸橼酸洗脱液洗脱，流速20ml/h。如纯化小鼠IgG1一般用pH6.0;纯IgG2a用pH4.0；纯化IgG2b用0.1mol/LpH3.0醋酸盐缓冲液0.1mol/LpH3.0glycine-HCl缓冲液洗脱。
↓
用pH3.0或4.0洗脱液洗脱时，用适量固体Tris直接中和含有IgG的洗脱液。
↓
收集洗脱液测OD值，根据实验需要透析除盐后进行浓度、纯度和活性测定。
（三）试剂器材
（1）SPA-Sepharose L-4B （pharmacia）
（2）磷酸缓冲液0.1mol/L pH8.0+0.02% NaN3
（3）枸橼酸缓冲液 0.1mol/LpH6.0 0.1mol/LpH4.0 +0.02% NaN30.1mol/LpH3.0
（4）1mol/L pH9.0 Tris溶液
（5）再生缓冲液：①0.1mol/L Tris含0.5mol/L NaCl调整pH至8.5+0.02% NaN3;②0.1mol/L 醋酸钠含0.5mol/L NaCl调整pH至4.5+0.02%NaN3。
（四）注意事项
（1）SPA-Sepharose CL-4B凝胶价格昂贵，可再生后反复使用10～20次左右。方法：先用10倍柱体积0.1mol/L pH8.5 Tris含0.5mol/L NaCl溶液洗脱柱上的残存杂蛋白；再用10倍柱体积0.1mol/L pH4.5醋酸钠缓冲液含0.5mol/L NaCl溶液洗脱柱上的残存杂蛋白；0.1mol/L pH8.0磷酸缓冲液平衡，4℃贮存。
（2）SPA-Sepharose CL-4B亲 合层析法还可用于：①除去抗体液中IgG,检测非IgG抗体（如IgM）的生物学活性；②除去木瓜蛋白酶或胃蛋白酶水解IgG后的Fc段；③吸收或纯化免疫复合物。
（3）狗、猫的多克隆IgM和IgA以及单克隆IgA和IgM也具有与SPA结合的能力。
五、和液相色谱纯化小鼠腹水中单克隆抗体
从小鼠腹水中纯化McAb的方法有盐析、离子交换层析、凝胶过滤和亲合层析等。应用TSK DEAE-SPW离子交换层析柱从小鼠腹水中纯化McAb不仅纯化速度快，回收率和得率高 ，而且保持良好的生物学活性。
（一）原理
根据离子交换原理，将经硫酸铵粗提的含McAbγ球蛋白上样结合于层析柱上，通过增加洗
脱液中的离子强度，洗脱并收集蛋白峰。
（二）操作步骤
腹水离心10000 g,10min，除去细胞和杂质，在4℃下逐滴加入饱和硫酸铵溶液，使终浓度为40%饱和硫酸铵
↓搅拌20～30min
离心，沉淀用40%饱和硫酸铵洗涤2次后溶于PBS，对缓冲液A（pH8.5,
20mmol/L Tris缓冲液）透析除盐
↓4℃过夜
用带有1000μl样品环的高压加样活门将透析后粗提物加样于经缓冲液A液平衡的TSK
DEAE SPW离子交换层析柱
↓
洗脱流速1ml/min
0～1min ：0→5%缓冲液B（20nmol/L
Tris, Ph 8.5,含2.0
mol/L醋酸钠）
1～2 min（ 线性梯度洗脱）：5→20%缓冲液B
20～22min：20→0%缓冲液B
↓
洗脱液用紫外280nm进行监测
↓
收集蛋白峰，进行含量、纯度和活性测定
（三）试剂和器材
（1）TSK
DEAE SPW离子交换层析柱 （75mm×7.5mm,Bio
Rad）
（2）液相色谱仪（包括控制系统、溶剂传递系统、高压加压活门和紫外280nm监测系统）
（3）PBS，缓冲液A和B。
（四）注意事项
（1）所用缓冲液和加样粗提物均需0.2μm滤膜过滤。
（2）在本实验条件下，IgG1峰一般在线性梯度洗脱开始11-12min。但不同类和亚类抗体以及不同特异性McAb
的存留时间（retention
time）有所差异。
【附录】
制备单克隆抗体常用的试剂
1．RPMT-1640培养液 其中含2mmol/L 谷氨酰胺，25
mmol/L Hepes,5×10-5mol/L
RPMT-1640*培养液 上述溶液加10%～20%灭活小牛血清
3．HT母液×100
次黄嘌呤（H）
1.0×10-2mol/L
136.1mg
胸腺嘧淀核苷（T） 1.6×10-3mol/L 38.8mg
蒸馏水 100ml
4. A母液×100
氨基喋呤（A） 4×10-3mol/L
1.76mg
蒸馏水 90.0ml
1mol/LNaOH 0.5ml
溶解后,加1mol/L
HCl 0.5ml,再补加蒸馏水至100ml 。
5．HAT选择培养液
RPMI-1640培养液
80ml
灭活小牛血清 20ml
HT母液×100
1ml
A母液×100
1ml
用5%NaOH调节 pH至7.4左右。
6．HT培养液
RPMI-1640培养液
80ml
灭活小牛血清
20ml
HT母×100
1ml
用5%NaOH调节 pH至7.4左右。
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