01 ATAC-seq 原理介绍
染色体结构
人类基因组DNA直线长度接近2m，而细胞的平均直径一般在几十微米，要保证DNA的复制和基因表达调控能够准确、高效的进行，需要将细胞核中的DNA经过多个水平高度有序的包装。
2个H3-H4二聚体和2个H2A-H2B二聚体形成约11nm的组蛋白八聚体，DNA缠绕其上形成核小体，每个核小体上大约含有146bp的DNA，核小体相互串联成为30nm水平纤丝染色质。细胞周期的不同时期，染色质浓缩程度不同，在分裂间期，染色质相对松散，具有转录活性的同时DNA暴露区域也可被特定的核酸酶接近并切割，而在分裂期，染色质进一步包装为结构紧密的染色体状态，此时呈现出转录惰性。
染色质可接近性概念
染色质分为常染色质和异染色质，在结构上常染色质折叠压缩程度低，处于伸展状态。DNA复制、基因转录时，DNA的致密高级结构变为松散状态，这部分打开的染色质，称之为开放染色质（open chromatin）。染色质一旦被打开，就允许一些调控蛋白，比如转录因子和辅因子与之相结合，染色质的这一特性，就叫做染色质可接近性（chromatin accessibility）。这一特性反映了染色质转录活跃程度。特定条件下的染色质开放性变化可以提供大量的基因表达调控信息。
Nature Reviews Genetics, 2014, 15(4):272.
图2：染色质的可接近性转换
转录因子及基因表达调控
真核生物转录调控过程是大量的顺式作用元件与反式作用因子相互作用的结果，具有调控功能的反式作用因子通过结合染色质开放区域调控真核细胞基因的表达。转录因子识别并结合起始位点上游序列，如GC Box、CAAT Box和TATA Box等顺式作用元件，从而启动基因的开放表达。远端调控的增强子，沉默子、绝缘子同样也可以通过结合顺式作用元件参与调控基因表达的开放和关闭。转录因子与基因组结合时，取代了核小体的位置，暴露出DNA，使其对酶的切割更为敏感。在此基础上，利用染色质对DNase的敏感性，鉴定活化的调控序列。基因表达调控是一个动态平衡的过程，在转录和翻译中，染色体三维结构也会处于动态变化中。
全基因组染色质可接近性研究
目前染色质可接近性的研究方法主要通过酶解或者化学方法来分离可接近区域或者受保护区域的DNA序列，然后再经过高通量测序分析。转座酶引入高通量测序之前，基因组范围内染色质可接近性的研究方法主要包括 MNase-seq，DNase-seq和FAIRE-seq，这些方法可以帮助我们在大量的细胞系和组织样本中鉴定出转录因子的结合位点、转录活性开始的位置、核小体和核小体修饰、增强子和绝缘子等。
MNase-seq：微球菌核酸酶（Micrococcal nuclease，MNase）是一种限制性外切酶，进行片段化处理时，将DNA切成缺口后，逐个切除寡核苷酸，直到获得被核小体包裹或者被转录因子绑定的区域为止。目前MNase消化法和二代测序联合使用，通过定性和定量的方式来识别基因组范围内的平均核小体占据率、定位以及染色质开放区域。
图4：MNase-Seq原理图
DNase-seq：基因活跃表达时启动区域部分序列可能解旋成单链，从而不能继续缠绕在核小体上，使启动区DNA裸露在组蛋白表面，形成对DNaseI的超敏现象。容易被DNase｜切割的位点称为超敏感位点。这些位点是调控元件如启动子、增强子、绝缘子和转录因子等的结合位点。DNase-seq技术与MNase-seq技术互补，利用DNase｜优先切割超敏感位点然后对生成的片段进行测序。该方法可用于检测特定转录因子等结合位点。
FAIRE-seq： FAIRE （Formaldehyde Assisted Isolation of Regulatory Elements）甲醛辅助分离调控元件，是借助有机溶剂甲醛对染色体中裸露的DNA 进行固定，通过细胞裂解与超声打断再进行CHCL3抽提获取水相中的DNA，在CHCL3抽提的过程中，蛋白未交联的DNA溶于水相中，而蛋白结合型的DNA留在两相界面，实验准备时间3-4天。将FAIRE-seq与ChIP-seq、DNase-seq联用可以用于揭示转录因子结合位点、核小体位置分布、染色质开放区域以及三者之间的关系。
这些研究染色质开放区域、核小体定位、转录因子占位或者染色质生物学“状态”的注释方法都涉及多个试验流程，操作复杂，需要大量细胞作为研究样本，并且样本准备过程非常繁琐。
为了解决这些问题，2013年Standford 大学 William Greenleaf 实验室的Buenrostro等发布了一项整合的、多维的遗传学分析方法-ATAC-seq，这种方法通过Tn5转座酶将测序的adapters插入到基因组上的“可接近”区域来标记调控区域。
ATAC-seq
ATAC-seq 全称 Assay for Transposase Accessible Chromatin with high-throughput sequencing，是利用转座酶研究染色质可接近性的高通量测序技术。其原理是利用转座酶Tn5可切割开放染色质区域的特性，对Tn5酶捕获到的DNA序列进行测序。DNA转座，是把DNA序列从染色体的一个区域搬运到另外一个区域的现象，由DNA转座酶来实现。只要人为地将携带已知DNA序列标签的转座复合物（即下图中带红／蓝色序列标签的转座酶Tn5复合物）与细胞核一起孵育，再利用带P5、P7以及index的引物进行PCR扩增即可形成文库，经过测序就可以得到开放染色质的区域信息。
ATAC-seq 可低至20个细胞便能快速的获取调控的多维信息，更加适用于珍贵稀少的样本，且ATAC-seq无片段选择性，所以这种方法可以同时获得“开放”染色质的位置、转录因子的结合位点、核小体的调控区域和染色质状态等信息。
相对于其他三种染色质开放区域研究，ATAC-seq经过一次实验，能够获得染色体在某个特定时空条件下所有开放染色质区域，并不仅仅局限于某个转录因子的结合位点，或者某个特定的组蛋白乙酰化区域。
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