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2009/9/29 8:52:52ELISA法检测立克次体
立克次体(Rickettsia)是一类专性活细胞内寄生的原核细胞微生物,具有细胞壁,含有RNA和DNA,以二分裂繁殖。需在细胞内繁殖,不能在无细胞的人工培养基中生长。它是属于人兽共患的自然疫源性疾病。临床上常见的有普氏立克次体、莫氏立克次体、恙虫病立克次体和Q热立克次体等,它传播的疾病主要是斑疹伤寒、恙虫病和Q热。检测血清中立克次体的特异性方法包括:免疫荧光法、ELISA、间接血凝法、乳胶凝集法和微量凝集法等。ELISA法特异性强、敏感性高、可重复性好,现已广泛应用于检测各种立克次体感染,但其缺点是需要使用纯化的抗原。本节仅对Q热立克次体抗体ELISA法进行介绍。
[检测方法]ELISA法
[方法学原理, 将可溶Q热立克次体吸附于固相载体上,洗去未吸附的抗原,加入待检血清使其与载体上吸附的抗体连接,洗涤后加入酶标记的抗人血清球蛋白,温育后漂洗,加底物溶液,底物降解出现呈色反应,颜色改变的程度与待检血清的含量成正比。
[标本准备]
取新鲜末梢血或静脉血。如采血后24h内不能进行试验,分离血清后将其保存于
[试剂]
1.0.05mol/LpH 7.4 PBS-Tween-20
2.0.01mol/LpH 9.6碳酸盐缓冲液
3.HRP标记抗人球蛋白血清
4.邻苯二胺底物溶液
5.2mol/L H2S04
6.纯可溶性Ⅱ相Q热立克次体抗原(制备方法见微量凝集试验检测Q热立克次体抗体)
[仪器) 酶标仪或全自动酶联免疫检测仪。
(检测步骤]
1.用0.05mol/LpH 9.6碳酸盐缓冲液稀释抗原使成每毫升含蛋白10/
2.用0.01mol/L pH 7.4 PBS-Tween—20洗3次,用于。
3.被检血清经含
4.用0.Olmol/L pH 7.4 PBS-Tween—20洗3次,甩干。
5.加酶标记抗体,每孔0.2ml,
6.用0.01mol/L pH 7.4 PBS-Tween-20洗3次,甩干。
7.加底物溶液,每孔0.2ml,室温避光保存15—30min,各孔加入2mol/l H2S04 1滴终止反应,用酶标光度计490nm测每孔吸光度值(A值)。
(正常参考值] Q热立克次体抗体阴性
[注意事项)
1.可溶性抗原必须纯净,否则影响结果。
2.每次试验应同时做2份阳性及2份阴性对照。
3.其他注意事项同检测HBsAg的ELISA。
[临床意义]
1.血清诊断为Q热zui常用的特异性诊断方法,其特异性很高,未发现与其他疾病有交叉反应。
2.在发病过程中,Q热抗体滴度不断增长,恢复期抗体水平高于急性期4倍以上,则对确诊Q热有重要意义。
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3.Q热现症诊断主要依据Ⅱ相抗体水平的上升。一般来说,发病1周左右血清中即有Ⅱ相补体结合抗体出现。若第1相抗体一直保持较高水平,或第1相抗体滴度高于第Ⅱ相滴度,则往往说明感染仍然存在。如患者血清Ⅱ相抗体滴度超过1:200提示为慢性Q热,特别在伴有感染性心内膜炎时更有意义。
4.1977年,Cracea等提出,在Q热急性期Ⅱ相抗原的微量凝集试验阳性率达85.3%。