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ELISA法检测立克次体

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2009/9/29 8:52:52

ELISA法检测立克次体

 

    立克次体(Rickettsia)是一类专性活细胞内寄生的原核细胞微生物,具有细胞壁,含有RNADNA,以二分裂繁殖。需在细胞内繁殖,不能在无细胞的人工培养基中生长。它是属于人兽共患的自然疫源性疾病。临床上常见的有普氏立克次体、莫氏立克次体、恙虫病立克次体和Q热立克次体等,它传播的疾病主要是斑疹伤寒、恙虫病和Q热。检测血清中立克次体的特异性方法包括:免疫荧光法、ELISA、间接血凝法、乳胶凝集法和微量凝集法等。ELISA法特异性强、敏感性高、可重复性好,现已广泛应用于检测各种立克次体感染,但其缺点是需要使用纯化的抗原。本节仅对Q热立克次体抗体ELISA法进行介绍。

    [检测方法]ELISA

    [方法学原理,  将可溶Q热立克次体吸附于固相载体上,洗去未吸附的抗原,加入待检血清使其与载体上吸附的抗体连接,洗涤后加入酶标记的抗人血清球蛋白,温育后漂洗,加底物溶液,底物降解出现呈色反应,颜色改变的程度与待检血清的含量成正比。

    [标本准备]

    取新鲜末梢血或静脉血。如采血后24h内不能进行试验,分离血清后将其保存于-20环境中。检测时,使样本恢复至室温。

    [试剂]

    1005molLpH 74 PBS-Tween-20

    2001molLpH 96碳酸盐缓冲液

    3HRP标记抗人球蛋白血清

    4.邻苯二胺底物溶液

    52molL H2S04

    6.纯可溶性Q热立克次体抗原制备方法见微量凝集试验检测Q热立克次体抗体

    [仪器)  酶标仪或全自动酶联免疫检测仪。

    (检测步骤]

    1.用005molLpH 96碳酸盐缓冲液稀释抗原使成每毫升含蛋白101g左右,包被酶标板,每孔02ml,于37环境中2h后,于4环境中过夜。

    2.用001molL pH 74 PBS-Tween—203次,用于。

    3.被检血清经含1gL牛血清清蛋白的PBS-Tween-20l200稀释,加人相应孔中,同时加2孔已知阳性对照和2孔阴性对照,放37环境中2h

   4.用0OlmolL pH 74 PBS-Tween—203次,甩干。

    5.加酶标记抗体,每孔02ml37环境中2h

    6.用001molL pH 74 PBS-Tween-203次,甩干。

    7.加底物溶液,每孔02ml,室温避光保存15—30min,各孔加入2moll H2S04 1滴终止反应,用酶标光度计490nm测每孔吸光度值(A

    (正常参考值]  Q热立克次体抗体阴性

    [注意事项

    1.可溶性抗原必须纯净,否则影响结果。

    2.每次试验应同时做2份阳性及2份阴性对照。

    3.其他注意事项同检测HBsAgELISA

    [临床意义]

    1.血清诊断为Q热zui常用的特异性诊断方法,其特异性很高,未发现与其他疾病有交叉反应。

2.在发病过程中,Q热抗体滴度不断增长,恢复期抗体水平高于急性期4倍以上,则对确诊Q热有重要意义。

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    3Q热现症诊断主要依据相抗体水平的上升。一般来说,发病1周左右血清中即有相补体结合抗体出现。若第1相抗体一直保持较高水平,或第1相抗体滴度高于第相滴度,则往往说明感染仍然存在。如患者血清相抗体滴度超过1200提示为慢性Q热,特别在伴有感染性心内膜炎时更有意义。

    41977年,Cracea等提出,在Q热急性期相抗原的微量凝集试验阳性率达853%。

 

 

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