肿瘤坏死因子与γ-干扰素抗膀胱肿瘤协同作用的实验研究

研究重组人肿瘤坏死因子（rHTNF）与γ-干扰素（IFN-γ）协同抗膀胱肿瘤的作用机理，探索治疗膀胱肿瘤的新方法。

　　材料与方法　人膀胱肿瘤细胞株BIU-87由北京医科大学泌尿外科研究所提供。（1）用MTT法^[1]测定rHTNF或IFN-γ，以及在单独应用和联合应用时，在不同药物浓度及不同作用时间内对BIU-87细胞的zui大杀伤率。酶标仪测定吸光度A值。杀伤率（%）=（对照孔A值-实验孔A值）/对照孔A值×100%。（2）对经过IFN-γ（0.15μg/ml）作用6小时与未经IFN-γ作用的对照组BIU-87细胞，分别行放射配体结合时间、解离和特异性竞争试验，通过Scatchard图计算受体数目及亲和力，进行rHTNF受体分析，观察IFN-γ对TNF受体的影响。（3）IFN-γ对rHTNF内化率和降解率的影响：经IFN-γ作用6小时和未经IFN-γ作用的BIU-87细胞分别与¹²⁵I-rHTNF于37℃反应3小时后，离心沉淀细胞。将细胞悬浮于0.1mmol/L、pH 3.0的甘酸-盐酸缓冲液中，洗掉结合在细胞膜上的¹²⁵I-TNF，测定细胞内剩余的放射性，作为内化量。50%的三氯醋酸可溶解¹²⁵I-rHTNF降解产物，同时沉淀未降解的¹²⁵I-rHTNF，溶液中的放射性即代表¹²⁵I-rHTNF的降解量。然后计算细胞内¹²⁵I-rHTNF与细胞zui大结合¹²⁵I-rHTNF的比值作为内化率；50%三氯醋酸溶液中的放射性与内化放射性的比值即为降解率。

　　结　果　（1）rHTNF和IFN-γ单独应用时对BIU-87细胞的zui大杀伤率分别为61%和15%，两者联合应用时对BIU-87细胞的zui大杀伤率达89%，明显高于rHTNF单独应用时对BIU-87细胞的zui大杀伤率（P＜0.05）。（2）¹²⁵ I-rHTNF与BIU-87细胞于37℃反应3小时可达平衡状态。解离曲线表明该反应呈可逆性。非标记的rHTNF可竞争性抑制¹²⁵ I-rHTNF与BIU-87细胞的结合。IFN-γ对该结合试验无抑制作用。IFN-γ使BIU-87细胞表面受体数量由0.41×10^-11nmol/细胞增加至0.92×10^-11nmol/细胞，对受体的亲和力无显著影响。（3）IFN-γ可显著提高BIU-87细胞对¹²⁵I-rHTNF的内化和降解的量，但对内化率和降解率无显著影响。

　　讨　论　TNF由激活的单核巨噬细胞和活化的T淋巴细胞及部分肿瘤细胞分泌，具有多种生物活性，是迄今发现的抗肿瘤活性zui强的细胞因子，其可能成为有一定临床应用价值的抗癌生物制剂。不同类型肿瘤细胞显示对TNF不同的反应：细胞毒性、生长抑制及无作用；甚至同一种类型细胞的不同细胞株对TNF作用亦表现出不同的反应。一般认为耐受TNF的肿瘤细胞能产生小剂量的内源性TNF，内源性TNF通过诱导保护性蛋白的产生，减弱TNF对肿瘤细胞的毒性^［2］。本研究结果表明，rHTNF对膀胱肿瘤细胞株BIU-87的zui大杀伤率为61%。IFN-γ和TNF对许多肿瘤细胞的生长抑制有协同作用，作用机制尚不清楚。本试验发现IFN-γ和rHTNF对BIU-87细胞的杀伤亦有协同作用，其zui大杀伤率可达89%。其协同作用可能部分与INF-γ增加BIU-87细胞表面的rHTNF受体表达有关。

　　TNF严重的毒副作用限制了临床应用。目前已经有几种TNF衍生物研制成功。本研究提示：TNF局部用药是合理的，同时选择毒副作用较轻的TNF衍生物与IFN-γ等与其协同抗肿瘤作用的细胞因子应用，可在一定程度上减轻TNF的毒副反应。