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[摘要] 目的:观察牛磺酸对血小板衍生生长因子（PDGF）诱导的系膜细胞增殖及细胞外基质分泌的影响,并探讨其作用的可能机制。方法:体外传代培养的大鼠系膜细胞,经一定量的牛磺酸和（或）PDGF作用48 h后,用噻唑蓝（MTT）法检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞周期,ELISA方法检测细胞外基质（Ⅳ型胶原及层粘连蛋白）含量,免疫细胞化学方法检测C-jun、C-fos的表达。结果:与对照组比较,10、20 ng/ml PDGF可明显促进系膜细胞增殖,影响细胞周期,使G0~G1期细胞减少,S期细胞增加,并能明显促进细胞外基质的分泌及C-jun、C-fos的表达（P<0.01）,而20或40 mmol/L牛磺酸作用于系膜细胞后,可明显抑制PDGF（20 ng/ml）诱导的细胞增殖、细胞外基质分泌及C-jun、C-fos的表达。结论:牛磺酸对PDGF诱导的系膜细胞增殖及细胞外基质分泌有显著抑制作用,其机制可能与牛磺酸抑制C-jun、C-fos表达有关。

[关键词] 牛磺酸 血小板衍生生长因子 系膜细胞 细胞增殖 细胞外基质

Inhibitory effects of taurine on proliferation and extracellular matrix secretion of mesangial cells inducedby plaet-derived growth factor

[ABSTRACT] Objective: To investigate the effects of taurine on proliferation and extracellular matrix （ECM） secretion ofrat mesangial cells（MC） induced by plaet-derived growth factor （PDGF）in vitro,and to inquire into the possible mecha-nism.Methods: Cell proliferation was assessed by MTT colorimetrichttp://www.51lunwen.com/miniao/ assay,cell cycle was analyzed by flow cytometry, ECMcollagenⅣand laminin were measured by ELISA,effects of taurine and PDGF on expression of C-jun and C-fos was assessedby immunocytochemistry.Results:PDGF significantly promoted MC proliferation dose-dependently,with cell cycle shortened,cells of phrase G0-G1reduced,cells of phrase S increased,and it also markedly promoted secretion of ECM and expression ofC-jun and C-fos（P<0.01）.Meanwhile,taurine significantly inhibited proliferation of MC,secretion of ECM and expression ofC-jun and C-fos.Conclusion:Taurine can markedly inhibit proliferation of MC and secretion of ECM.The mechanism might berelated to blocked mitosis dependent on C-jun and C-fos.
　　

[KEY WORDS]  taurine;plaet-derived growth factor;mesangial cell;cell proliferation; extracellular

 matrix系膜细胞（mesangial cell, MC）增殖是多种肾小球疾病共同的病理改变特征。MC的过度增生以及由此引起的各种细胞因子的分泌和细胞外基质（ex-tracellular matrix,ECM）的增加在肾小球硬化的发生、发展中起着重要作用。牛磺酸是机体含量zui丰富的自由氨基酸,具有多种生物学效应[1]。近年研究显示,牛磺酸可抑制高糖所引起的MC脂质过氧化和胶原生成[2],并且对糖尿病大鼠肾功能具有显著保护作用[3]。血小板衍生生长因子（plaet-derivedgrowth factor,PDGF）是一种系膜细胞能自身分泌的促增殖因子,许多实验已证实各种系膜增殖性病变中均有PDGF的表达,而且其增高程度与系膜增殖程度呈正相关[4]。本研究通过观察牛磺酸对PDGF诱导的体外培养大鼠MC增殖及ECM分泌的影响,并探讨其作用的可能机制,旨在初步阐明牛磺酸抗肾小球硬化的作用机制。
　　

1 材料和方法

1.1 试剂 大鼠MC株由本科肾病实验室建立[5],牛磺酸、PDGF为Sigma公司产品,噻唑蓝（MTT）为Amersco公司产品,DMEM培养液为Gibco公司产品,兔抗大鼠C-jun、C-fos单克隆抗体及ABC免疫试剂盒为武汉博士德公司产品,Ⅳ型胶原ELISA试剂盒由*上海生物化学研究所提供,层粘连蛋白ELISA试剂盒由*医学研究所生物中心提供,其他试剂均为Sigma公司产品及进口分析纯。
　　1.2 牛磺酸和PDGF对MC增殖的影响 应用MTT法测定细胞增殖。取对数生长期MC接种于96孔板（1×104/孔）,24 h后加无血清DMEM培养液,37℃孵育24 h,使细胞生长同步进入休止期。弃上清液,分别加入含不同浓度PDGF （0、10、20ng/ml）或同时含有不同浓度牛磺酸（20、40 mmol/L）的无血清DMEM培养液作用48 h（每组设6个复孔）,经锥虫蓝（台盼蓝）染色,活细胞达95%以上,于刺激结束前4 h,加入MTT（5 g/L）,酶标仪参考波长690 nm,读取波长550 nm处光密度（D）值。
　　1.3 牛磺酸和PDGF对MC细胞周期的影响 同1.2方法处理细胞,药物作用48 h后,胰酶消化,PBS清洗,70%预冷乙醇悬浮固定细胞,-20℃过夜。加入等量PBS再洗2遍,碘化丙啶避光显色,上流式细胞仪检测,用MCYCLE软件分析细胞周期。
　　1.4 细胞上清液Ⅳ型胶原及层粘连蛋白的检测 应用ELISA方法检测

不同浓度牛磺酸和PDGF作用48 h后细胞上清液中Ⅳ型胶原及层粘连蛋白含量。
　　1.5  C-jun、C-fos表达的免疫细胞化学检测 取对数生长期MC,制备成细胞悬液,接种于盖玻片上,制成细胞爬片,用含PDGF（0、20 ng/ml）或同时含牛磺酸（40 mmol/L）的无血清DMEM培养液作用48 h,PBS漂洗,冰丙酮固定,用ABC法进行免疫细胞化学检测（一抗为兔抗大鼠C-jun、C-fos单克隆抗体）,DAB显色,苏木精复染细胞核。以PBS为一抗作阴性对照,以博士德公司提供的人肿瘤细胞切片作阳性对照。结果判断:细胞核着棕黄色为阳性细胞,细胞核着淡蓝色为阴性细胞。光学显微镜下观察,摄片,采用IDA-2000软件分析MC的平均光密度。
　　1.6 统计学处理 所有数据用x-±s表示,采用t检验作统计学处理,P<0.05为显著性界限。
　　

2 结 果

2.1 牛磺酸对PDGF诱导的MC增殖的影响 经10、20 ng/ml PDGF处理24 h后,MC增殖较对照组明显增加;而20、40 mmol/L牛磺酸能显著抑制PDGF（20 ng/ml）诱导的MC的增殖,结果见表1。

　　在所用浓度范围内,牛磺酸和PDGF对MC均无明显损伤作用。
　　2.2 牛磺酸对PDGF诱导的MC细胞周期的影响 各浓度PDGF处理组G0~G1期细胞比例逐渐降低,而S期细胞比例逐渐升高,G2期变化不明显;而牛磺酸加PDGF组G0~G1期细胞较单纯PDGF组有明显升高,说明牛磺酸能明显阻断PDGF引起的促细胞增殖作用,见表1。

　　2.3 牛磺酸对PDGF诱导MC分泌Ⅳ型胶原及层粘连蛋白的影响 MC单纯经PDGF处理后,Ⅳ型胶原及层粘连蛋白含量均较对照组明显增加;而同时加入牛磺酸后,Ⅳ型胶原及层粘连蛋白含量则均较单纯PDGF处理组显著下降,结果见表1。
　　2.4 牛磺酸对PDGF诱导的MC C-jun、C-fos表达的影响 MC经PDGF（20 ng/ml）处理后,C-jun、C-fos的表达均较对照组明显加强,平均光密度值分别为（0.38±0.120）vs（0.31±0.02）（P<0.05）,（0.36±0.01）vs（0.30±0.02）（P<0.01）;而同时加入牛磺酸（40 mmol/L）后,C-jun、C-fos的表达均较单纯PDGF处理组明显下降,平均光密度值分别为0.33±0.01（P<0.01）和0.29±0.01（P<0.05）。图1显示了各组C-jun的表达情况。
　　

3 讨 论

MC增殖及ECM产生增加是导致肾小球硬化的主要原因,如何有效防治MC增生及ECM的聚集,对延缓肾小球硬化的发生、发展起到关键性作用。牛磺酸是一种含巯基的β氨基酸,具有平衡细胞渗透压、维持细胞膜稳定性、调节细胞钙稳态和抗氧自由基损伤等多种生物学效应[1]。文献报道,牛磺酸能抑制大鼠贮脂细胞、肝细胞的增殖[6],并且近年体内研究也显示牛磺酸具有明显的抗肝纤维化作用,但牛磺酸是否具有抗肾小球硬化作用尚不清楚。
　　MC作为一种活性代谢细胞,能自分泌如PDGF、转化生长因子β（TGFβ）等多种细胞因子,其中PDGF能通过与细胞膜上的受体结合发挥其生物学效应,是一种促有丝分裂作用zui强的多肽生长因子,在MC增殖中有十分重要的作用[7]。因此,本研究以PDGF为刺激因素,以MC为靶细胞,结果发现,在10~20 ng/ml浓度范围内,PDGF可明显刺激MC增殖,影响细胞周期,使G0~G1期比例降低,S期比例增高,而细胞活力未受影响;而牛磺酸在20~40 mmol/L浓度范围内,对MC也无明显损伤作用,却能显著抑制PDGF诱导的MC增殖,影响细胞周期,使G0~G1期细胞比例增高,S期细胞比例降低,表明牛磺酸可阻断PDGF对MC的促增殖作用。C-jun、C-fos蛋白分别是由原癌基因c-jun、c-fos编码,参与转录因子AP-1的组成,调节细胞的生长、分化。近年研究也已证实PDGF、高糖等均可促进它们的表达,而且其表达强度与MC增殖程度呈正相关[8]。本实验采用免疫细胞化学方法检测MC的C-jun、C-fos表达,结果显示MC经PDGF（20 ng/ml）处理48 h后,C-jun、C-fos蛋白的表达均明显增强,而加入牛磺酸（40 mmol/L）后,其促进作用明显减弱。由此可以推测,牛磺酸可能通过抑制C-jun、C-fos表达而抑制PDGF对MC的促增殖作用。
　　ECM是一种动态结构,正常生理情况下,ECM处于不断产生和降解的动态平衡中。MC增殖后,可导致ECM大量分泌,而ECM对MC有正反馈作用,以至这类物质在基质中聚集增多[9]。有研究发现,MC增生性肾炎大鼠MC培养3~5 d,Ⅳ型胶原及层粘连蛋白含量则显著增加10倍[10]。近年有文献报道PDGF可刺激ECM的合成,在肾炎的发生、发展中起着重要作用[11]。本实验结果也显示,PDGF能显著促进Ⅳ型胶原及层粘连蛋白的分泌,而牛磺酸能明显抑制PDGF诱导的ECM分泌,提示牛磺酸尚可抑制PDGF对ECM分泌的促进作用,其明确的机制有待进一步探讨。
　　总之,本研究证实了牛磺酸可以抑制PDGF诱导的MC增殖及ECM的分泌,为牛磺酸防治肾小球硬化提供了一定的实验依据。由于牛磺酸是正常机体内源性的代谢物质,无明显的细胞损伤作用,因而,它可能具有潜在的临床应用前景。