实 验 方 法
杂交瘤的制备一般应包括动物免疫、小鼠细胞细胞融合及HAT筛选、抗体的检测和克隆化几个基本操作步骤。免疫组化抗体
一、动物免疫
动物免疫的方法很多，一般有常规免疫法、脾内一次性免疫法、短程免疫法和体外免疫法等。脾内一次性免疫法具有用量少、免疫程序短、不加佐剂且所得单克隆抗体的特异性较高等特点。
由于单次免疫抗原刺激后数日内就进行细胞融合，因此不存在所谓“优势克隆”的问题，从而更容易获得多种不同特异性的单克隆抗体，也能助于筛选出差别微小的两种抗原的单克隆抗体。但该方法的缺点是，其免疫效果要等杂交瘤筛选时才明了, 因此在实验时有一定的随机性；此外对一些免疫原性较差的抗原决原簇的单克隆抗体的筛选较困难。常规免疫法比较可靠，由于在融合前能通过测定血清中的抗体滴度来证实免疫效果，因此实验成功的把握性较大。但由于免疫动物多次反复接受相同抗原的刺激, 会使某些特定的淋巴细胞克隆大量增殖, 易形成“优势克隆”, 因此所产生单克隆抗体的种类较少, 很可能多个克隆所产生的单克隆抗体都是针对于同一个抗原决定簇的。此外此法的免疫程序太长，费时费力。而短程免疫法和体外免疫法均各有其优缺点，在此不再介绍。在利用杂交瘤技术制备单克隆抗体时，一般采用常规免疫法。
在本实验中，我们使用人软状病毒脾内一次性免疫法来免疫动物，以达到快速简便的实验效果，也适于学生操作。具体方法如下。
1. 纯化分离已灭活的人轮状病毒，并定量。
2. 用戊*钠对2只10周龄的BALB/c小鼠进行麻醉，按每克体重注射0.05g戊*馀的量对小鼠进行腹腔注射，5min后小鼠即进入昏迷状态。
3. 无菌打开小鼠腹腔，暴露出脾脏，用1ml注射器将含有30ng的0.1ml抗原（人轮状病毒）液分别注射到两只小鼠脾脏内。
4. 将脾脏轻轻复位，缝合伤口，饲养备用。
5. 免疫三天后取脾细胞进行融合。
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二、细胞融合及HAT筛选
细胞融合方法一般有病毒介导的细胞融合、PEG介导细胞融合及电融合等。病毒介导的细胞融合方法要涉及仙台病毒的培养和灭活，尤其是仙台病毒的培养条件要求严格，过程比较复杂，因此现在一般不使用此方法。电融合为80年代刚刚兴起的一种融合方法，它除需要昂贵的电融合仪外，另外还需要特定的技术条件。目前zui常使用的融合方法是PEG介导的细胞融合方法, 该方法具有操作简便、快速省时且融合效果好等优点。
本实验使用的是一种快速PEG融合方法，具体操作如下:
（一） 细胞悬液的制备（均在无菌条件下操作）
在杂交瘤技术中要使用三种细胞悬液；脾细胞悬液、SP2/0-Ag14骨髓瘤细胞悬液和腹腔巨噬细胞（用作饲养细胞）悬液。
1、脾细胞悬液的制备
取已免疫BALB/c小鼠，于免疫后第三天用眼球放血处死（收集流出血液制备阳性血清），用70%精浸泡5min后，无菌打开腹腔，取出脾脏，去除多余的脂肪组织，用37GKN液清洗2-3次。向脾内注射0.2ml GKN液后（使脾脏膨胀以得于细胞散开），放入培养皿中，加入5mlGKN，用L型6号针头将脾细胞轻轻挤出，用滴管吹打数次以使细胞散开成单细胞状态。用不锈钢网将此细胞悬液过滤到一个50ml塑料离心管中，再加入10ml GKN液，混匀后，1000r/min心与5min，弃上清，用10ml GKN液重新悬浮细胞，取0.1ml均匀细胞悬液进行活细胞计数，其余细胞悬液入37℃备用。
2、SP2/0-Ag14细胞悬液的制备
将SP2/0-Ag14细胞用RPMI 1640*培养液作增殖培养，每天传代一次，连续传代3天，使细胞在融合时达到对数生长期。取3~5瓶（50ml的培养瓶）SP2/0 Ag14细胞，倾去原来的培养上清液，每瓶加入37℃ GKN液4ml，将细胞悬浮起来，收集各瓶中细胞液放入一个50ml塑料离心管中1000r/min离心5min（为省时可同脾细胞一同离心），弃去上清液，用10ml 37℃ GKN液将细胞悬浮均匀, 取0.1ml用活细胞计数，其余悬液放37℃备用。
3、腹巨噬细胞悬液的制备
杂交瘤细胞开始生长时, 需要有饲养细胞, 一般用腹腔巨噬细胞作为饲养细胞。
取12周龄BALB/c小鼠，拉颈处死，浸入70%酒精中消毒5min。在解剖盘中无菌打开腹部皮肤，暴露出腹膜，向腹腔中注入10ml RPMI 1640*培养液, 按摩腹部1~2min后, 用注射器抽出腹腔液（一般可抽出8~9ml），放入一个50ml塑料离心管中, 置37℃备用。一般一只小鼠取出的腹腔巨噬细胞可接种3~5块24孔或96孔培养板。可根据需要接种的培养板数来确定所使用饲养细胞的量。
（二） 细胞融合及HAT筛选（在无菌条件下操作）
已计数脾细胞和骨髓瘤细胞按6:1的数量
比例混合于离心管
↓
1000r/min离心5min
↓弃上清
轻弹离心管底部，使沉淀细胞松散
↓40℃预热1~2min
边摇边在45秒内匀速加工50% PEG溶液
↓
90秒内边摇边向管内加速加入37℃ GKN液
↓室温静置10min
1000r/min离心10分钟
↓
加入37℃的腹腔巨噬细胞悬液和40ml HAT培养液
↓
将细胞悬液分种于二块24孔板和96孔板
↓
37℃ 5% CO2孵箱中培养
↓
观察细胞的生长情况
↓
5天用HAT培养液半量换液10天用HT培养液半量换液
14天用HT培养液全量换液
↓
当杂交瘤细胞长满孔底面积的1/2~2/3时, 即可取培养上清液进行抗体检测
三、抗体的检测
杂交瘤技术所使用的抗体检测方法必须具有简便、快速、敏感而且能在短时间内检测大量样品的特点。常用的方法有酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）、间接免疫荧光法（Indirect immunofluorescence, IIF）、放射免疫法（radioimmunoassay, RIA）和双相扩散法等。间接免疫荧光法需要使用荧光显微镜，价格昂贵，灵敏度也较低，而且不能用于可溶性抗原的抗体检测，但其优点是能进行反应的定位。放射免疫法操作较复杂，所用的液体闪烁仪及制剂价格昂贵，但其灵敏度较高。而酶联免疫吸附法则操作简便快速、灵敏度高（0.5ng/ml），且适于大规模操作, 它需要酶联免疫检测仪, 价格较便宜。双相扩散法操作简单，不需要昂贵仪器，实验周期也较短，但灵敏度较低，一般可用于抗体的初步检测。
在中常常使用酶联免疫吸附法和双相扩散法。
（一） 酶联免疫吸附法
纯人轮状病毒用包被液稀释到10mg/100ml
↓
将此浓度抗原液按每孔100ml的量分别加入40孔酶标板孔中
轻轻震荡使液体覆盖孔底
↓
4℃过夜
↓
倾去酶标板液体用PBSS-Tween20缓冲液洗涤
每次洗3min共洗3次
↓
1%小牛血清白蛋白室温下封闭30min
↓
甩去封闭液用PBSS-Tween20缓冲液洗3次，每次3min
↓
每孔加入待测杂交瘤培养上清液100ml
留出4孔加入100ml阳性血清作为阳性对照
4孔加入100ml HT培养液作为阴性对照
4孔加入PBSS-Tween20缓冲液100ml作为空白对照。
↓
加入标有辣根过氧化物酶的羊（或兔）抗鼠IgG，37℃孵育60min
↓
甩去酶标二抗液，用PBSS-Tween20缓冲液清洗5次，每次3min
↓
加入100ml邻苯二胺底物反应液，室温暗处反应30min
↓
每孔加入1滴2mol/L H2SO4以终止反应，用酶联免疫检测仪进行结果检测
（呈现棕褐色反应者为阳性反应。检测出上清液为阳性的培养板孔即为阳性孔，可进行克隆化实验）
（二） 双相扩散法
1. 用含有0.01%NaN3和1%琼脂的磷酸缓冲液倒平板, 每块9cm培养皿加18ml。
2. 用打孔器在倒好的琼脂平板上均匀打7个孔，*一孔的孔经为4mm，周围6孔的孔经为6mm*孔与周围孔的间距为8~10mm。
3. *孔加入待测的杂交瘤培养上清液至孔满，周围孔也分别加入羊（或兔）抗鼠二抗IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgM的标准抗体制品至孔满。吸干待测孔中的液体后将培养皿倒置。
4. 40℃放置5~7h或37℃过夜。
5. 取出琼脂板观察结果，出现沉淀线可初步判定为免疫反应呈阳性, 另外还可根据沉淀线的位置来确定所含抗体的类型。
6. 有阳性免疫反应的培养上清液原来所在的培养孔即为阳性孔, 可进行克隆化实验。
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四、克隆化 （在无菌条件下操作）
对阳性孔中的杂交瘤细胞进行克隆化培养的方法一般有有限稀释法、软琼脂平板法和显微操作法等。软琼脂平板法操作比较繁琐，特别是在大量克隆化培养时需要制备很多平板，费时费力。而显微操作法需要使用显微操纵仪，价格昂贵，而且不适于大量样品克隆化。但有稀释法却具有简便快速且适于大规模操作等优点，因此在杂交瘤细胞的克隆化操作中常常使用这种方法。有限稀释法的具体方法如下:
1. 将阳性孔中的杂交瘤细胞吹打均匀悬液，取0.1ml进行活细胞计数。
2. 用含有腹腔巨噬细胞的RPMI 1640完成全培养液对杂交瘤细胞进行梯度稀释, 使其浓度分别为每毫升50个、15个、5个细胞。
3. 把三种稀释度的杂交瘤细胞悬液分种于三块孔培养板孔中（0.2ml/孔）。
4. 置37℃ 50%CO2孵箱中培养。
5. 培养到第五天便可看到较小的细胞克隆, 待单细胞克隆长满孔底面积的1/2~1/3时，再进行抗体检测。阳性孔中的单克隆杂交细胞即为阳性克隆，所分泌的抗体即为单克隆抗体。
获得单克隆杂交瘤细胞后，可通过免疫交叉实验来确定其所分泌的单克隆抗体是不是人轮状病毒所*的。没有交叉反应的单克隆抗体即可用于人轮状病毒的临床论断和治疗。有必要时可进行再克隆实验，以建立能稳定分泌异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
实 验 结 果
一、免疫效果的初步观察
在细胞融合前取出脾脏时，如果脾脏比正常状态明显膨大，则说明有免疫效果, 用此脾脏的脾细胞进行细胞融合成功的可能性较大；如果脾脏无明显膨大则说明免疫效果不佳，可及时终止实验，以免浪费人力物力而一无所莸。
二、融合结果的观察
细胞融合后，将培养板置倒置显微镜下观察，则可看到各种类型的细胞, 有未融合的脾细胞和SP2/0-Ag14骨髓瘤细胞，也有融合细胞。在融合细胞中, 有的已完成融合过程，变成了融合细胞，有的仍然呈哑铃形，在高倍镜下仔细观察即可分辨出细胞中有两个核，可以计算一下融合率来判定融合效果。
在融合后第3~5天。便可看到SP2/0-Ag14骨髓瘤细胞大量死亡。死亡细胞逐渐变得不透明，zui终解体，丧失贴壁性，从孔底脱落，以换液可清除部分死亡细胞以免影响活细胞的生长。培养孔中较大的透亮细胞为杂交瘤细胞。脾细胞较小，于在融合后第14天左右开始大量死亡，经换液可去除部分死亡细胞以减少对活细胞的毒害作用。
在融合后第5天左右便有杂交瘤细胞开始分裂, 从而出现一些的较小的细胞克隆, 一个培养孔往往会出现多个细胞克隆。
三、克隆化结果的观察
在克隆化后第5天左右即可看到小的细胞克隆，检查培养板并标出含有单个细胞克隆的培养孔。单细胞克隆的外形应为圆形，形状非圆形的细胞团则可能不是单细胞克隆。
