上海恒远生化试剂网
2012/10/31 11:22:14
如何确定蛋白纯化*膜截留分子量
背景:
仕必纯提供低蛋白结合的生物技术级纤维素酯（CE） 透析膜管和Float-A-Lyzer® G2即用型透析装置，包括100-,000,000道尔顿的9种截留分子量规格。膜截留分子量是指截留90%样品时的膜孔径大小，在蛋白纯化应用中，选择zui适截留分子量的透析膜是去除不需要的小分子污染物所必须的。
由于在脱盐、 pH值调整及缓冲液置换等应用中，离子物质通常小于膜孔径，且至少比大分子物质小1000倍，所以选择截留分子量在3.5 kD至100kD 之间的膜即可在1-2天内达到所需的分离效果。*需要考虑的是，所选的膜截留分子量应小于需要截留的大分子物质的分子量。
透析是对不稳定的蛋白、敏感的酶以及精细化合物进行温和分离的方法，以维持物质的活性、功能以及稳定的水相环境。但是，需要清除的小分子污染通常只比目标蛋白小10-100倍，所以并不是所有截留分子量规格的膜都可以达到相同的分离效果。因此，在纯化大分子物质的应用中，选择*的膜截留分子量尤为重要。
目的:
比较使用截留分子量分别为20kD、50kD和100kD的Float-A-Lyzer® G2 即用型透析装置（FAL-G2）透析24h后的相对分离效果，实验处理目标为截留抗体（IgG，166kD），并清除不需要的小分子物质：分子量比抗体小100倍的维他命B12（Vit B12，1.35kD）以及分子量比抗体小10倍的细胞色素C（Cyt C，12.4kD）。
其次，为透析应用建立通用的*截留分子量确定方法，如蛋白纯化。
方法:
1. 3种不同分子量溶液制备如下：目标蛋白（IgG-166kD：1 mg/ml 0.9% PBS），1/10分子量污染物（细胞色素C-12.4kD：0.2 mg/ml 0.9%PBS）和1/100分子量污染物（维他命B12-1.35kD：0.2mg/ml 0.9% PBS）。
2. 9个FAL-G2（5ml容量规格）每个上样4ml溶液，具体设置如下：IgG分别上样至20kD、50kD和100kD截留分子量膜管；Cyt C分别上样至20kD、50kD和100kD截留分子量膜管；Vit B12分别上样至20kD、50kD和100kD截留分子量膜管。
3. 9个FAL-G2均于室温下在独立的透析容器中透析24h，每个透析容器包括1L 的0.9% PBS缓冲液，并分别于3h和8h时置换新鲜缓冲液。
4. 在透析开始后0、3、8和24h，分别从每个 FAL-G2取出200μl 测试样品，用0.9% PBS以1:4 稀释，并用紫外可见分光光度计检测稀释后溶液浓度（IgG检测波长为280nm，Cyt C检测波长为406nm，Vit B12检测波长为366nm）。
5. 计算36个测试样品稀释前浓度，与透析前原始浓度比较（0h 测试样品），确定每种截留分子量FAL-G2（20kD、50kD和100kD）在3个时间点（3、8和24h）的溶质截留百分比。
结果 & 讨论:
Float-A-Lyzer® G2配有螺旋帽，允许透析过程中取样检测，可以不中止透析而得到实时的测试数据。
绘制每种截留分子量（20kD、50kD和100kD）下目的蛋白IgG（166kD）、1/10分子量污染物Cyt C（12.4kD）和1/100分子量污染物Vit B12（1.35kD）的截留趋势图。
所有3种截留分子量膜（20kD、50kD和100kD）在透析24h后均可保留几乎所有的目的蛋白IgG。
20kD 截留分子量可清除大部分的Vit B12（87.6%），但只清除一小部分的Cyt C（12%）。
50kD 截留分子量可清除几乎所有的VitB12（97.5%），但只清除24%的Cyt C。
100kD 截留分子量可*清除Vit B12（99.4%），并清除大部分的Cyt C（72%）。
结论:
IgG纯化实验总体的截留分子量效率为：100kD > 50kD > 20kD；
100kD 为IgG纯化的*截留分子量。
从不同截留分子量的截留曲线可以看到，50kD和100kD膜可在24h内有效清除维他命B12（1/100分子量污染物）；而20kD 截留分子量大约需要36h。只有100kD截留分子量可有效清除细胞色素C（1/10分子量污染物），*清除需要2-3天。20kD和50kD截留分子量不能有效清除细胞色素C。
通过透析进行蛋白纯化的一般规则：
1. 透析通常要求目的蛋白或大分子的分子量比需要清除的污染物至少大10倍，理想情况下为100倍。
2. 蛋白纯化的*截留分子量为小于需截留蛋白大小的zui高截留分子量。
3. 若要在1-2天内完成纯化，膜截留分子量应至少比污染物分子量大100倍。
4. 若要在2-3天内完成纯化，膜截留分子量应至少比污染物分子量大10倍。
