Western Blotting实验操作圻明培训资料四

[主要试剂]
1、SDS-PAGE 试剂：
2、匀浆缓冲液：1.0M Tris-HCl（pH 6.8）1.Oml；10%SDS 6.0ml；β-巯基乙醇 0.2ml；
ddH2O 2.8ml。
3、转膜缓冲液：甘氨酸 2.9g；Tris 5.8g；SDS 0.37g；甲醇200ml；加ddH2O 定容至
1000ml。
4、0.01M PBS（pH7.4）：NaCl 8.0g；KCl 0.2g；Na2HPO4 1.44g；KH2PO4 0.24g；加ddH2O
至1000ml。
5、膜染色液：考马斯亮兰 0.2g；甲醇80ml；乙酸2ml；ddH2O118 ml。包被液（5%脱
脂奶粉，现配）：脱脂奶粉1.0g 溶于20ml 的0.01M PBS 中。
6、显色液：DAB 6.0mg；0.01M PBS 10.0ml；硫酸镍胺 0.1ml；H202 1.0μl。
7、兔抗猪R 蛋白抗体、HRP 标记羊抗兔IgG（二抗）。
[操作步骤]
1、蛋白质样品获得：细菌诱导表达后，可通过电泳上样缓冲液直接裂解细胞，真核细
胞加匀浆缓冲液，机械或超声波室温匀浆0.5-1min。然后4℃，13,000g 离心15min。取上清液作为样品。
2、电泳：制备电泳凝胶，进行SDS-PAGE。
3、转移（半干式转移）：
（1）电泳结束后将胶条割至合适大小，用转膜缓冲液平衡，5min×3 次。
（2）膜处理：预先裁好与胶条同样大小的滤纸和NC 膜，浸入转膜缓冲液中10min。
（3）转膜：转膜装置从下至上依次按阳极碳板、24 层滤纸、NC 膜、凝胶、24 层滤纸、
阴极碳板的顺序放好，滤纸、凝胶、NC 膜对齐，每一步去除气泡，上压500g 重物，将
碳板上多余的液体吸干。接通电源,恒流1mA/cm2，转移1.5hr。转移结束后，断开电源将膜
取出,割取待测膜条做免疫印迹。将有蛋白标准的条带染色，放入膜染色液中50s 后，在50%
甲醇中多次脱色，至背景清晰，然后用双蒸水洗，风干夹于两层滤纸中保存，留与显色结果
作对比。
4、免疫反应：
（1）用0.01M PBS 洗膜，5min ×3 次。
（2）加入包被液，平稳摇动，室温2hr。
（3）弃包被液，用0.01M PBS 洗膜，5min×3 次。
（4）加入一抗（按合适稀释比例用0.01M PBS 稀释，液体必须覆盖膜的全部），4℃ 放
置12hr 以上。阴性对照，以1%BSA 取代一抗，其余步骤与实验组相同。
（5）弃一抗和1%BSA，用0.01M PBS 分别洗膜，5min×4 次。
（6）加入辣根过氧化物酶偶联的二抗（按合适稀释比例用0.01M PBS 稀释），平稳摇动，
室温2hr。
（7）弃二抗，用0.01M PBS 洗膜，5min×4 次。
（8）加入显色液，避光显色至出现条带时放入双蒸水中终止反应。
[注意事项]
1、一抗、二抗的稀释度、作用时间和温度对不同的蛋白要经过预实验确定*条件。
2、显色液必须新鲜配置使用，zui后加入H2O2。
3、DAB 有致癌的潜在可能，操作时要小心仔细。