Western Blotting实验圻明培训资料

 一、基本原理
*部分：SDS-PAGE 电泳
1、蛋白中含有很多的氨基（+）和羧基（-），不同的蛋白在不同的PH值下表现出不同的电荷，
为了使蛋白在电泳中的迁移率只与分子量有关，我们在上样前，通常会进行一些处理（上样
缓冲液）。即在样品中加入含有SDS 和β-巯基乙醇的上缓冲液。SDS 即十二烷基磺酸钠
（CH3-（CH2）10-CH2OSO3- Na+），是一种阴离子表面活性剂，它可以断开分子内和分子间的
氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级结构； β-巯基乙醇是强还原剂，它可以断开半胱氨酸
残基之间的二硫键。电泳样品加入样品处理液后，经过高温处理，其目的是将SDS 与蛋白质
充分结合，以使蛋白质*变性和解聚，并形成棒状结构同时使整个蛋白带上负电荷；另外
样品处理液中通常还加入溴酚蓝染料，用于监控整个电泳过程；另外样品处理液中还加入适
量的蔗糖或甘油以增大溶液密度，使加样时样品溶液可以快速沉入样品凹槽底部。当样品上
样并接通两极间电流后（电泳槽的上方为负极，下方为正极），在凝胶中形成移动界面并带动
凝胶中所含SDS负电荷的多肽复合物向正极推进。样品首先通过高度多孔性的浓缩胶，使样
品中所含SDS 多肽复合物在分离胶表面聚集成一条很薄的区带（或称积层）。
2、电泳启动时，蛋白样品处于PH6.8 的上层，PH8.8 的分离胶层在下层，上槽为负极，下
槽为正极。出现了PH 不连续和胶孔径大小不连续：启动时Cl¯解离度大，Pro¯解离度居中，
甘aaCOO¯解离度小，迁移顺序为（PH6.8）Cl¯> Pro¯ >—COO¯。在Cl¯与Pro¯之间和Pro¯与—COO¯之间都将出现低离子区，同时也出现高电势，高电势迫使Pro¯向Cl¯迁移，—COO¯
向Pro¯迁移。如：一个Cl¯领路，—COO¯推动，蛋白在中间，这样就起到浓缩的作用了。
在浓缩胶运动中，由于胶联度小，孔径大，Pro¯受阻小，因此不同的蛋白质就浓缩到分离胶
之上成层，起浓缩效应，使全部蛋白质处于同一起跑线上。当蛋白质进入分离胶时，此时
Pro¯，Cl¯，甘aa 离子在PH8.8 的溶液中，Cl¯*电离而很快到达正极，甘aa 电离度加大
很快跃过蛋白质，而到达正极，只有蛋白质分子在分离胶中较为缓慢的移动。由于Pro¯在
电泳过程中，受到溶液离子的变化而PH 值发生变化，但每一瞬间，其所带电荷数除以单位质量是不同的，所以带负电荷多者迁移快，反之则慢，这就现了电荷效应。由于胶孔径小，
而且成为一个整体的筛状结构，它们对大分子阻力大，小分子阻力小，起着分子筛效应，也
就是蛋白质在分离胶中，以分子筛效应和电荷效应而出现迁移率的差异，zui终达到彼此分开。