新霉素残留检测的ELISA方法

  新霉素为检测对象,建立了新霉素酶联免疫检测方法,并应用于食品中新霉素残留检测,达到了高灵敏度和高特异性的检测要求。在成功合成抗原的基础上,制备多克隆抗体,并对其进行鉴定,并对单克隆抗体的制备进行了初步探究。 新霉素是从弗氏链霉菌中分离出来的广谱抗菌性抗生素,对革兰氏阴性菌和大多数的革兰氏阳性菌均有显著的抑菌作用.在我国已广泛应用于农牧渔业中,并因为在动物体内日益严重的残留问题引起高度关注。
  为快速而有效的检测和监测动物源产品中新霉素的残留,本实验首先合成了新霉素*抗原,在此基础上制备针对新霉素的多克隆抗体（pAb）和单克隆抗体（mAb）,研究并建立了针对新霉素残留检测的ELISA方法。 利用戊二醛法合成新霉素*抗原,免疫新西兰大白兔,并zui终获得抗新霉素多克隆抗体,并建立了新霉素间接竞争性ELISA分析方法,并优化了包被原浓度、包被时间、竞争时间、pH等影响ELISA分析的实验条件。在*实验条件下,重新建立新霉素的抑制标准曲线。新霉素抗体的半数抑制率IC50为0.965 ng/mL,检测限0.01 ng/ml,线性范围为0.03～29.5 ng/ml。包被原*工作浓度为2000,抗体的工作浓度为16000。与庆大霉素、卡那霉素等四种氨基糖苷类化合物进行交叉反应性试验,交叉反应率均小于0.1%。
  本实验同时采用一步ELISA法对抗新霉素抗血清进行特异性检测,结果此方法针对新霉素的IC50为4.88 ng/mL,其结果与ic-ELISA的IC50相差不大,而且节省了40 min,能够方便地应用于现场快速检测。 在成功合成抗原的基础上,免疫BALB/C小鼠制备多克隆抗体,应用杂交瘤技术进行细胞融合,细胞融合率为95.57 %,阳性检出率为38.96 %,运用间接ELISA法进行筛选,再经过四次克隆化,zui终筛选出两株高灵敏,高特异性的单克隆细胞株,命名为2C6-F4-G10和3D4-F5-C3。