染色质免疫沉淀分析（ChIP）

染色质免疫沉淀分析（ChIP）

ChIP是目前确定与特定蛋白结合的基因组区域或确定与特定基因组区域结合的蛋白质的方法（图2—8），也可用于分析与转录、有丝分裂或DNA损伤相关的发生改变的组蛋白修饰。ChIP技术和芯片技术的结合有利于确定全基因组范围内染色体蛋白的分布模式以及组蛋白修饰情况。该技术主要应用于：①组蛋白修饰研究；②转录调控分析；③药物开发研究；④有丝分裂研究；⑤DNA损失与凋亡分析。ChIP是深入分析癌症、心血管疾病以及*神经系统紊乱等疾病的主要代谢通路的一种非常有效的工具。

实验步骤

    可采用Upstate公司的Chromatinlmmunoprecipitation（ChIPs）AssayKit进行操作。

注意：步骤（3）～（7）应该置于冰浴中操作。

    （1）处理10C1TI培养皿上1X10‘细胞，确保目的基因处于转录激活状态，同样处理另一个10cm培养皿用于细胞计数。

    （2）将组蛋白与DNA相互交联，加入终浓度为1％甲醛到培养基上，37℃孵育10min。

    （3）尽可能的吸去培养液，用含有蛋白酶抑制剂的冷PBS洗两次。

    （4）将细胞刮人锥形管中。

    （5）4℃，2 000r／min离心4min。将SDS裂解液放置室温，使SDS溶解，并加入蛋白酶抑制剂。

    （6）将细胞沉淀加入200／llSDS裂解液，冰上孵育10min（200／ul SDS裂解液是对于1X106细胞，如果有更多的细胞，要相应增加SDS裂解液的用量）。

    （7）将DNA用超声打断，DNA片段长度为200—1 000bp，应在冰浴中操作，同通过优化超声的条件，使DNA片段长度保持在200—1 000bp之间。

    （8）加人8u1 5mol／LNaCl，65℃，4h，解交联。

    （9）通过酚—氯仿提取DNA，并用含有溴化乙啶的2％琼脂糖凝胶电泳，观察超声打断DNA的效率。

    CHIP不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。而且，CHIP与其他方法的结合，扩大了其应用范围：CHIP与基因芯片相结合建立的CHIP-on-chip方法已广泛用于特定反式因子靶基因的高通量筛选；CHIP与体内足迹法相结合，用于寻找反式因子的体内结合位点；RNA-CHIP用于研究RNA在基因表达调控中的作用。由此可见，随着CHIP的进一步完善，它必将会在基因表达调控研究中发挥越来越重要的作用。