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2013/4/8 9:25:32脑源性神经营养因子 （ brain derived neur otr ophic fact or,BDNF）在脑内分布广泛 ,大脑皮层、 海马及基底前脑是其主要分布区 ,在基底前脑的胆碱能神经元及其末梢发现了 BDNF的受体 [ 12 3 ]。运动促进脑损伤后胆碱能神经元轴突的出芽再生 ,可能与 BDNF的增多有重要关系。本研究旨在探讨运动训练是否可使小鼠大脑中动脉闭塞 （middle cerebral artery oc2clusi on, MCAO）后 BDNF mRNA表达水平发生改变。
材料与方法
一、 材料
选雄性 C57 BL /6J小鼠 26只,体重为 20～30 g,鼠龄为 3～5个月。
二、 方法
（一 ）动物分组和运动训练方法
按 Beders on等[ 4 ]的方法 ,建立小鼠 MCAO模型 ,MCAO术后第 3天开始运动训练。随机将 26只小鼠分为运动 Ⅰ组 （ 9只 ） ,运动 Ⅱ 组 （9只 ）及对照组 （ 8只 ）。运动 Ⅰ组每天于跑笼中训练1 h,共训练 90 d;运动 Ⅱ 组先于跑笼中运动 15 d,停止运动 30 d,再置于跑笼中运动45 d,每天训练 1 h,其它处理与 Ⅰ 组相同;对照组每次置于跑笼中 ,但跑笼不转动。90 d后断头取大脑。
（二 ） BDNF基因mRNA表达的定量 RT2 PCR测定11脑组织中RNA的提取:小鼠BDNF引物是根据鼠神经细胞上BDNF mRNA全序列[ 5 ]（ gene bank accessi on no .X55573）而设计的 ,其序列为F 5′2GGA TG A GGA CCA GAAGGT TCG2 3,其位点为 296～316; R 5′2 ACC CTC AT A G AC ATGTTT GCG G2 3′,其位点为 460～439,由上海生工生物工程公司合成 ,扩增长度为 164 bp,使用浓度为 10 nmol /ml。脑组织中RNA的提取按 TR I zol Reagent试剂盒说明书进行 ,电泳得到5S、18S、28S总RNA条带 （图1）。同时用紫外分光光度计（ Phamacia Ultrospec 2000 ）测A260和A280的OD值 （ 1OD =40μg/ml RNA） ,计算所提取的总 RNA量 ,并使每次 A260 /A280比值保持在 1 . 8以上 ,置于 - 70℃下保存待测 ,于 1周内测定完毕21逆转录 （RT） 2 单链 cDNA的合成:等量取上述每个标本总RNA 2μg,分别逆转录成 cDNA。BDNF反应体系 （20μl） 5×RT Reacti on Buffer 2μl, 10 mmol /L dNTP 1μl,上、下引物各0 . 5μl （12 pM） ,MMLV2 逆转录酶 10 u,样品 RNA 2μg, Rnasin 10 u, DEPC外理的 dH2O加至10μl。反应条件: 37℃水浴下 60 min, 95℃下 5 min,即逆转录成 cDNA,作为模板 ,于 - 20℃ 下保存待测。31RT2 PCR反应:分别取上述逆转录的产品 cDNA 10μl与BDNF引物作 PCR:。反应体系模板 cDNA 10μl, Taq DNA聚合酶 1μl, 5 × RT Reacti on Buffer 4μl, 10 mmol /L dNTP 2μl,引物上游0 . 5μl、下游 1μl加水至 30μl,混匀后加入适量石蜡油 ,离心数秒钟 ,按下列条件扩增: 93℃预变性 3 min,此后 93℃30 s→57℃30 s→72℃45 s,共做 35个循环后, 72℃ 延伸5 min,取反应管中 RT2 PCR产物 5μl与 1μl溴酚兰指示剂充分混匀后,于 2%琼脂糖凝胶上电泳 （10 V / cm） 10～30 min,于凝胶成像及分析装置上观察结果。41RT2 PCR定量检测 cDNA含量 （即 mRNA表达量 ） : RT2PCR割胶纯化 ,严格按 Qiiagen公司纯化试剂盒 （Qiaex II Gel,Extracti on Kit）的说明书进行。纯化后的 RT2 PCR产物 ,在紫外分光光度计上测 A260的 OD值 （A260的 1OD = 50μg/ml cDNA） ,测得 cDNA浓度为 200μg/ml,取 5μl （ 1μg cDNA）做标准曲线 ,行系列的 10倍稀释 （ 10- 3～10- 11μcDNA） ,各样品同样亦取 5μl一起进行 PCR。PCR的反应体系 （20μl） : RT2 PCR产品5μl,标准品行 10倍系列稀释后亦各取 5μl, Tag酶 1 . 5μl, 5 ×RT Reacti on Buffer 6μl, 10 mM dNTP 2μl,上、 下游引物各1μl,加水至 20μl,混匀后加入适量石蜡油离心数秒钟。按下列条件扩增: 93℃ 预变性 3 min,然后 94℃ 45 s、 57℃ 45 s、 72℃1 min、 共做 30个循环后 , 72℃ 延伸 5 min,取反应管中下层液相即 RT2 PCR产物 5μl,与 1μl溴酚兰指示剂充分混匀后 ,于 2%琼脂糖凝胶上电泳 （10 V / cm） 20～30 min,见图 2, 3。各样品条带的峰面积值均在标准品峰面积值范围之内 ,用标准品的浓度和峰面积值在凝胶成像和分析装置上照相 ,用 Gel Base /GelBl ot Support软件对底片的电泳带行扫描分析。
三、 统计学分析
用 SPLM软件计算 ,以标准品浓度与峰面积做标准曲线 ,并进行曲线拟合 ,选出*曲线 ,代入样本峰面积 ,算出 cDNA浓度 ,即为 mRNA 初始表达量。用非参数多样本比较 ,Kruskal2 Wallis检验 3组差别。用 W ilcoxon检验做两两比较
