荧光素标记抗体技术

（一） 原理

目前用于抗体标记的荧光素主要有异硫氰酸荧光素（Fluorescein isothiocynate,FITC）或罗达明（Lis

samine rhodamine B200, RB200）。在硷性条件下 FITC 的碳酰胺键可与抗体赖氨酸的ε氨基共价结合，标

记后的抗体仍保持与相应抗原结合的能力。在荧光灯源紫外线或兰紫光激发下产生黄绿色荧光，通过在荧

光显微镜下观察或流式细胞仪分析可对相应抗原进行定性、定位或定量的检测。

（二） 操作步骤

将纯化的 IgG 抗体对 PH9～9.5 碳酸盐缓冲液透析过夜，

透析后抗体液移入小烧杯中

↓

称取适量 IFTC，加入二甲亚砜（DMSO）（FITC～1mg/1ml DMSO） 使终浓度为 1mgFITC／1mlDMSO

FITC／IgG 比例:如 IgG 浓度为 1mg／ml，FITC／IgG 比例约为 50μgFITC／mgIgG；

如 IgG 为 5～10mg／ml，则比例为 25μgFITC／ml IgG 在 10ml 小烧杯中先放入抗体

↓

按上述比例将 FITC-DMSO 溶液逐滴加入透析后的抗体溶液中

↓

将标记物用 PBS 加至 2.5ml，磁力搅拌器室温下避光搅拌 2h ↓

用 PD10 柱（Sephadex G25 柱）除去游离荧光素，先用 25ml PBS 淋洗 G25 柱

↓

收集 PBS 洗脱*个荧光素结合蛋白峰，测定 F／P 比值。第二个荧光素峰为游离荧光素

计算:

2.87×A495

F／P＝────────

A280-0.35×A495 合适的 F／P 值为 2～4。

（三） 试剂器材

1. 纯化的多克隆抗体或单克隆抗体。

2. FITC（Fluorescein-5-Lsothiocyanalte）或其它荧光色素。

3. PBS、DMSO4. PH9～9.5 碳酸盐缓冲液: Na2CO34.3g，NaHCO3 8.6g 加蒸馏水至 500ml。

5. PD10 柱（Sephadex G25 柱）

6. 磁力搅拌器，紫外分光光度计等

（四） 注意事项

1. FITC 保存于 4℃暗处，使用前待试剂瓶升至室温时开盖称取，以避免潮解。

2. FITC-DMSO 液要临用时配制。

3. 碳酸盐缓冲液要新鲜配制。