核被膜(nuclear envelope)是包被核内含物的双层膜结构,作为界膜,它把细胞核与细胞质分开,有利于稳定基因的结构,外核膜与胞质中的粗面内质网相邻,外表亦有核糖体附着,内核膜附着有一层纤维状蛋白网,该结构对内膜具有支撑作用。核间隙与粗面内质网腔相通,内含多种蛋白质和酶,核膜还控制着细胞核与细胞质之间的物质交换。
分离核膜几乎都以肝脏为原料,但不同类型的研究用不同的制备方法,有些方法适合于膜组成的研究,有些方法适合于酶与通透性研究。基本上分为低离子强度和高离子强度法。高离子浓度法用高浓度的阳离子使膜破裂,该方法能获得较高产量的膜。低离子浓度法可使膜具有形态完整并保留的酶活性高。Kaufmann等用高离子强度介质快速从鼠肝细胞核中分离完整核膜,几乎不受污染,对研究核基质和核被膜间的关系非常有用。Fraser等用DNase处理染色体分离核被膜碎片,染色体污染少。
本文讲述用高速冷冻离心机进行核膜的亚分级分离的方法和步骤。
1. 把核被膜(大约1~2mg蛋白质)悬浮在5ml冰冷的10mmol/L三乙醇胺-HCl、0.1mmol/L蔗糖(pH=7.5)中,再加入0.5ml 20%(体积分数) Triton X-100,在0℃孵育10分钟。
2. 该悬浮液,在45000gmax离心,使核被膜沉降。
3. 把沉淀重新悬浮在5mL相同的缓冲液里(不加去垢剂),再加入5ml 100mmol/L 三乙醇胺-HCl、2.0mol/L NaCl。
4. 在0℃孵育10分钟后,悬浮液再发步骤2离心,沉淀是管孔复合体叠层膜。
在所有步骤中,匀浆重悬是基本步骤,在往沉淀里加2~3滴甘油摇动或手工匀浆。用1%(质量浓度)柠檬酸(1ml/mg核蛋白)抽提细胞核来制备外核膜,通过低速离心上清液在120000gmax离心(6*14ml甩开转子,26500r/min)、4℃离心1小时来沉淀膜。
湖南湘立研制生产的几款医用离心机可以用来进行细胞分离,如DL5M/TDL5M两种型号的低速冷冻离心机可用来进行干细胞实验。XL03RH型控温离心机(低速冷冻离心机)可用来进行温度敏感型人体细胞分离。