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2013/6/24 11:24:22【作者】 李宝新；
【导师】 李玉坤；
【作者基本信息】 河北医科大学， 内科学， 2012， 博士
【摘要】 目的：骨质疏松症（Osteoporosis, OP）是一种以骨量丢失、骨微细结构改变而易发脆性骨折的全身性代谢疾病；2型糖尿病是以胰岛素分泌不足与胰岛素抵抗为主要特征，导致体内葡萄糖和脂质代谢紊乱的一种全身性代谢性疾病。由于生活方式和环境改变，二者发病率逐年增加。虽然传统意义上二者是*独立分开的两种疾病，但越来越多的研究证据表明骨质疏松症和2型糖尿病之间相互影响彼此相关，二者间可能存在共同的病理生理机制，但究竟二者之间通过什么途径或机制相互关联并不清楚。近年来，相关研究认为骨和肾组织是可同时影响骨质疏松和2型糖尿病发生和进展的两大重要靶器官，而是否同时存在某些机制或偶联因子通过肾和骨共同影响骨质疏松和2型糖尿病发生发展尚无明确报道。胰岛素信号通路在2型糖尿病发病中起重要作用，尤以胰岛素样生长因子-1（insulin-like growth factor-1, IGF-1）、胰岛素受体底物-1（insulinreceptor substrate-1， IRS-1）和胰岛素受体底物-2（insulin receptorsubstrate-2，IRS-2）作用明显。胰岛素信号通路受抑制可致胰岛素抵抗发生进而引发2型糖尿病；基因研究发现IGF-1、IRS-1和IRS-2缺失或表达降低均可致不同程度骨量下降和骨结构异常，同时有研究表明骨和肾组织可表达IGF-1、IRS-1或IRS-2，但三者在2型糖尿病合并骨质疏松骨和肾组织表达如何尚不清楚。维生素D是影响骨生长和矿化的重要激素，其活性形式1,25（OH）2D3在体内合成依赖肾、骨和肠结构和功能完整，而1,25（OH）2D3发挥作用又需与维生素D受体（Vitamin D receptor, VDR）结合。*1,25（OH）2D3缺乏可致骨量减少和骨质疏松发生，而近年来许多研究发现1,25（OH）2D3缺乏与2型糖尿病关系密切，成纤维细胞样生长因子23（fibroblast growth factor23, FGF23）和骨形态发生蛋白7（bonemorphogenetic protein7，BMP7）是近年来新发现可表达于骨和肾的重要因子，二者对1,25（OH）2D3有调节作用且可影响VDR表达，但VDR、FGF23和BMP7在2型糖尿病合并骨质疏松肾和骨同时表达如何尚无报道。2型糖尿病对骨质疏松的影响，较明确的是可通过影响成骨细胞抑制骨形成过程，成纤维细胞样生长因子2（fibroblast growth factor2，FGF2）和骨形态发生蛋白2（bone morphogenetic protein2，BMP2）是影响成骨细胞生长和作用的重要成骨因子，二者的表达异常或缺失可致成骨过程受抑制，两种因子均可于肾和骨组织表达，且二者在2型糖尿病中表达不一，但FGF2和BMP2在2型糖尿病合并骨质疏松肾和骨的表达如何尚无明确报道。本研究在既往研究成功制备2型糖尿病合并骨质疏松大鼠模型的基础上，对肾和骨共同表达但机制不同的相关因子进行分析，明确这些因子在2型糖尿病合并骨质疏松大鼠肾和骨组织的表达，探讨其表达意义，对2型糖尿病和骨质疏松发病机制提供新思路。方法：*部分：在既往研究制备2型糖尿病骨质疏松模型成功的基础上，于去卵巢术后4、8、12周每组大鼠随机选取5只拉颈处死，分离双侧股骨、胫骨、肾组织，取部分肾组织置4%多聚甲醛保存行肾组织病理学观察组织形态和结构变化，免疫组织化学染色观察NS组、NOVX组、DS和DOVX组肾组织IGF-1、IRS-1和IRS-2的表达部位，应用IHS评分观察各组阳性表达情况。双侧股骨、胫骨和部分肾组织液氮冷冻后-80℃保存行逆转录聚合酶链反应实验观察各组骨和肾组织IGF-1、IRS-1和IRS-2的mRNA表达，应用蛋白印迹法观察12周各组肾组织IGF-1、IRS-1和IRS-2的蛋白表达情况。第二部分：于去卵巢术后4、8、12周末每组大鼠随机选取5只拉颈处死，分离双侧股骨、胫骨、肾组织，取部分肾组织置4%多聚甲醛保存行免疫组织化学染色观察NS组、NOVX组、DS和DOVX组肾组织VDR、FGF23和BMP7的表达部位，应用IHS评分观察各组阳性表达情况。双侧股骨、胫骨和部分肾组织液氮冷冻后-80℃保存行逆转录聚合酶链反应实验观察各组骨和肾组织VDR、FGF23和BMP7的mRNA表达，应用蛋白印迹法观察12周各组肾组织VDR、FGF23和BMP7的蛋白表达情况。第三部分：于去卵巢术后4、8、12周末每组大鼠随机选取5只拉颈处死，分离双侧股骨、胫骨、肾组织，取部分肾组织置4%多聚甲醛保存行免疫组织化学染色观察各组肾组织FGF2和BMP2的表达部位，应用IHS评分观察各组阳性表达情况。双侧股骨、胫骨和部分肾组织液氮冷冻后-80℃保存行逆转录聚合酶链反应实验观察各组骨和肾组织FGF2和BMP2的mRNA表达，应用蛋白印迹法观察12周各组肾组织FGF2和BMP2的蛋白表达情况。结果：*部分：与非糖尿病组（NS组和NOVX组）相比，糖尿病组（DS组和DOVX组）大鼠肾组织HE染色观察到肾小球体积增大、髓袢腔扩张。应用免疫组化方法观察到各组大鼠肾组织均可见IGF-1、IRS-1和IRS-2阳性表达，其表达部位为肾小管上皮细胞胞浆内。IHS评分示随着病程时间延长，DOVX组IGF-1、IRS-1和IRS-2阳性表达均不同程度低于其他三组，且以12周为著。骨组织RT-PCR结果示DS组和DOVX组IGF-1、IRS-1和IRS-2的mRNA表达在4周、8周和12周均较其对照NS组和NOVX组有不同程度下降，NOVX组IGF-1、IRS-1和IRS-2的mRNA表达在12周均较DS组下降（P<0.05），12周时DOVX组IGF-1、IRS-1和IRS-2的mRNA表达均zui低（P<0.05）。肾组织RT-PCR结果示NOVX组IRS-1和IRS-2的mRNA表达在4周、8周、12较NS组下降（P<0.05），8周和12周时DS组IGF-1的mRNA表达较NOVX组下降（P<0.05），12周时DOVX组IGF-1、IRS-1和IRS-2的mRNA表达zui低。12周肾组织Westernblot蛋白表达结果示DOVX组和DS组IGF-1蛋白表达低于NOVX和NS组，DS组低于NOVX组（P<0.05）；DOVX和DS组IRS-1和IRS-2蛋白表达低于NS组（P<0.05），但NOVX组和NS组比较无明显差别。第二部分：应用免疫组化方法观察到各组大鼠肾组织均可见VDR、FGF23和BMP7阳性表达，其表达部位为肾小管上皮细胞胞浆内。IHS评分示随着病程时间延长，DOVX组和NOVX组VDR阳性表达低于NS组（P<0.05），12周DS组低于NS组（P<0.05）；8周和12周DOVX组和DS组FGF23阳性表达较NOVX组和NS组明显增加，DOVX组表达zui高（P<0.05）；随着周数延长DOVX和DS组BMP7阳性表达较NS组降低，且DOVX组表达zui低（P<0.05）。骨组织RT-PCR结果示DS组和DOVX组VDR、FGF23和BMP7的mRNA表达在4周、8周、12周均较其对照NS组和NOVX组有不同程度下降，且12周时NOVX组VDR和BMP7较NS组mRNA表达明显下降（P<0.05），DOVX组VDR、FGF23和BMP7的mRNA表达均zui低（P<0.05）。肾组织RT-PCR结果示DS组和DOVX组VDR和BMP7的mRNA表达在4周、8周和12周均较NS组和NOVX组有不同程度下降，以DOVX组表达zui低，同时DS组BMP7的mRNA表达低于NOVX组（P<0.05）；而DS组和DOVX组肾组织FGF23的mRNA表达在8周和12周较NS组明显升高（P<0.05），以DOVX组表达zui高。12周肾组织Western blot蛋白表达结果示DOVX组和NOVX组VDR蛋白表达低于DS和NS组，NOVX组低于DS组（P<0.05）；DOVX和DS组BMP7蛋白表达低于NS组，且DS组BMP7蛋白表达低于NOVX组（P<0.05）；DOVX和DS组FGF23蛋白表达明显高于NS组，且DOVX组明显高于NOVX组（P<0.05）。第三部分：应用免疫组化方法观察到各组大鼠肾组织均可见FGF2和BMP2阳性表达，其表达部位为肾小管上皮细胞胞浆内。IHS评分示随着病程时间延长，DS组FGF2阳性表达高于于NS组和NOVX组（P<0.05）；8周和12周DOVX组和DS组BMP2阳性表达较NOVX组和NS组明显降低，DOVX组表达zui低（P<0.05）。骨组织RT-PCR结果示4周、8周和12周时DOVX组和NOVX组FGF2和BMP2表达较NS组表达下降（P<0.05）；12周时NOVX组FGF2和BMP2表达低于DS组（P<0.05）；两者DOVX组表达zui低。肾组织RT-PCR结果示4周时各组FGF2和BMP2表达比较无明显差别（P>0.05）；8周和12周时DOVX组和NOVX组FGF2和BMP2表达较NS组表达下降，但DS组FGF2表达高于NS组（P<0.05），12周时NOVX组FGF2表达zui低，DOVX组和DS组BMP2表达无明显差别（P>0.05）。12周肾组织Western blot蛋白表达结果示DS组FGF2蛋白表达高于其他三组（P<0.05）；NOVX组和DS组BMP2蛋白表达低于NS组，NOVX组和DS组无明显差别，DOVX组BMP2蛋白表达zui低（P<0.05）。结论：12型糖尿病合并骨质疏松大鼠骨和肾组织IGF-1、IRS-1和IRS-2表达均有不同程度降低，肾和骨组织胰岛素信号通路偶联改变可为研究2型糖尿病合并骨质疏松发生提供新思路；22型糖尿病合并骨质疏松大鼠骨和肾组织FGF23表达与VDR和BMP7不一致，为研究维生素D在2型糖尿病和骨质疏松发病中的作用提供思路；32型糖尿病合并骨质疏松大鼠骨组织FGF2和BMP2表达降低；2型糖尿病合并骨质疏松大鼠肾组织BMP2表达降低；单纯2型糖尿病大鼠肾组织FGF2表达较对照组增加，但其变化与骨质疏松发生无直接关系，为研究成骨因子在2型糖尿病合并骨质疏松发生中的作用提供思路。 还原
