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人晚期糖基化终末产物试剂盒的操作方法

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2013/7/16 13:46:48

实验原理

本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人晚期糖基化终末产物 (AGEs)水平。用纯化的人晚期糖基化终末产物 (AGEs)抗体包被微孔板,制成固相抗体,往包被单抗的微孔中依次加入晚期糖基化终末产物 (AGEs),再与HRP标记的晚期糖基化终末产物 (AGEs)抗体结合,形成抗体-抗原-酶标抗体复合物,经过*洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成zui终的黄色。颜色的深浅和样品中的晚期糖基化终末产物 (AGEs)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值),通过标准曲线计算样品中人晚期糖基化终末产物 (AGEs)浓度。

试剂盒组成

1

30倍浓缩洗涤液

20ml×1瓶

7

终止液

6ml×1瓶

2

酶标试剂

6ml×1瓶

8

标准品(960pg/ml)

0.5ml×1瓶

3

酶标包被板

12孔×8条

9

标准品稀释液

1.5ml×1瓶

4

样品稀释液

6ml×1瓶

10

说明书

1份

5

显色剂A液

6ml×1瓶

11

封板膜

2张 

6

显色剂B液

6ml×1/瓶

12

密封袋

1个

操作方法:

1.         标准品的稀释:本试剂盒提供原倍标准品一支,用户可按照下列图表在小试管中进行稀释。

480pg/ml

5号标准品

150μl的原倍标准品加入150μl标准品稀释液

240pg/ml

4号标准品

150μl的5号标准品加入150μl标准品稀释液

120pg/ml

3号标准品

150μl的4号标准品加入150μl标准品稀释液

60pg/ml

2号标准品

150μl的3号标准品加入150μl标准品稀释液

30pg/ml

1号标准品

150μl的2号标准品加入150μl标准品稀释液

2.         加样:分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂,其余各步操作相同)、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50μl,待测样品孔中先加样品稀释液40μl,然后再加待测样品10μl(样品zui终稀释度为5倍)。加样将样品加于酶标板孔底部,尽量不触及孔壁,轻轻晃动混匀。

3.         温育:用封板膜封板后置37℃温育30分钟。  

4.         配液:将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用

5.         洗涤:小心揭掉封板膜,弃去液体,甩干,每孔加满洗涤液,静置30秒后弃去,如此重复5次,拍干。

6.         加酶:每孔加入酶标试剂50μl,空白孔除外。

7.         温育:用封板膜封板后置37℃温育30分钟。  

8.         洗涤:小心揭掉封板膜,弃去液体,甩干,每孔加满洗涤液,静置30秒后弃去,如此重复5次,拍干。

9.         显色:每孔先加入显色剂A50μl,再加入显色剂B50μl,轻轻震荡混匀,37℃避光显色15分钟.

10.     终止:每孔加终止液50μl,终止反应(此时蓝色立转黄色)。

11.     测定:以空白空调零,450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。 测定应在加终止液后15分钟以内进行。


 

 

 

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