人的白介素8（IL8）检测试剂盒部分使用说明书

[预期应用]

本试剂盒运用双抗体夹心ELISA法定量测定人血清、血浆、组织匀浆、细胞培养上清 或其它相关生物液体中IL8含量。

[试剂盒内容]

[需自备的设备及试剂]

1、450±10nm滤光片的酶标仪（建议仪器使用前提前预热）

2、单道或多道微量加液器及吸头

3、稀释样品的EP管

4、蒸馏水或去离子水

5、吸水纸

6、盛放洗液的容器

[操作步骤]

1、 加样：分别设标准孔、待测样品孔、空白孔。设标准孔7孔，依次加入100μL不同浓度的标准品（见试剂准备2）。空白孔加100μL（见试剂准备第二步zui后一管），余孔加待测样品100μL，酶标板加上覆膜，37^oC温育2小时。

2、 弃去液体，甩干，不用洗涤。

3、 每孔加检测溶液A工作液100μL（临用前配制），酶标板加上覆膜，37^oC温育1小时。

4、 弃去孔内液体，每孔用350μL的洗涤液洗涤，浸泡1-2分钟，吸去（不可触及板壁）或甩掉酶标板内的液体，在实验台上铺垫几层吸水纸，酶标板朝下用力拍几次（也可轻拍将孔内液体拍干），重复洗板3次。zui后一次洗涤后，要把孔内的洗涤液*甩干。自动洗板机亦可。

5、 每孔加检测溶液B工作液（临用前配制）100μL，加上覆膜，37^oC温育30分钟。

6、 弃去孔内液体，甩干，洗板5次，方法同步骤4。

7、 每孔加底物溶液90μL，酶标板加上覆膜，37^oC避光显色（反应时间控制在15-25分钟，不要超过30分钟。当标准孔的前3-4孔有明显的梯度蓝色，后3-4孔梯度不明显时，即可终止）。

8、 每孔加终止溶液50μL，终止反应，此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物溶液的加入顺序相同。如出现颜色不匀一，请轻轻晃动酶标板以使溶液混合均匀。

9、 在确保酶标板底无水滴及孔内无气泡后，立即用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度（O.D.值）。

注意：

1、 试剂准备：准备一次实验所需要的酶标条，其它的可从微孔板上拆下，密封，按照说明书要求保存，以备下次使用。

2、 加样：实验操作中请使用一次性的吸头，避免交叉污染。加样时注意不要有气泡，将样品加于酶标板底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。加样或加试剂时，*个孔与zui后一个孔加样之间的时间间隔如果太大，将会导致不同的“预温育”时间，从而明显地影响到测量值的准确性及重复性。因此，一次加样时间（包括标准品及所有样品）控制在10分钟内。推荐设置复孔进行实验。

3、 温育：为防止样品蒸发，实验时请将加上盖或覆膜的酶标板置于湿盒内，以避免液体蒸发，洗板后应尽快进行下步操作，任何时侯都应避免酶标板处于干燥状态，同时应严格遵守给定的温育时间和温度。

4、 洗涤：充分的洗涤非常重要，在每次洗涤过程中，都要将洗涤液*甩干。洗涤过程中反应孔中残留的洗涤液应在滤纸上拍干，勿将滤纸直接放入反应孔中吸水，同时要消除板底残留的液体和手指印，避免影响zui后的酶标仪读数。如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实 验过程中。

5、 反应时间的控制：加入底物后请定时观察反应孔的颜色变化（比如，每隔10分钟观察一次），如颜色较深，请提前加入终止液终止反应，避免反应过强从而影响酶标仪光密度读数。

6、 底物：底物请避光保存，在储存和温育时避免强光直接照射。

7、 如果实验室内湿度低于60%，推荐使用加湿器提高湿度水平。

[实验原理]

将IL8抗体包被于96孔微孔板中，制成固相载体，向微孔中分别加入标准品或标本，其中的IL8与连接于固相载体上的抗体结合，然后加入生物素化的IL8抗体，将未结合的生物素化抗体洗净后，加入HRP标记的亲和素，再次*洗涤后加入TMB底物显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成zui终的黄色。颜色的深浅和样品中的IL8呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（O.D.值），计算样品浓度。

[计算]

各标准品及样本O.D.值扣除空白孔O.D.值后作图（七点图），如设置复孔，则应取其平均值计算。以标准品的浓度为纵坐标（或对数坐标），O.D.值为横坐标（或对数坐标），绘出标准曲线（*方程式应依回归方程计算的R²值来定，以R²值越趋近于1为好）。推荐使用专业制作曲线软件进行分析，如curve expert 1.30，根据样品O.D.值，由标准曲线查出相应的浓度，乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与O.D.值计算出标准曲线的回归方程式，将样品的       O.D.值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

[检测范围]

15.6pg/mL-1,000pg/mL

[zui低检测限]

6.4pg/mL

此值为20个空白样品（即标准品稀释液）测定的平均值加二倍标准差所对应的浓度。

[稳定性]

经测定，试剂盒在有效期内按推荐温度保存，其活性降低率小于5%。

试剂盒稳定性由加速破坏试验测定。具体方法为：将试剂盒放置于37^oC破坏3天后重新测定其各项指标，并比较破坏前后的测定值。（参考《中国生物制品规程》，生物试剂在37^oC每稳定一天，相当于4^oC保存2个月）。

注意：

为减小外部因素对试剂盒破坏前后检测值的影响，实验室的环境条件需尽量保持一致，尤其是实验室内温度、湿度及温育条件。其次由同一实验员来进行操作可减少人为误差。

[实验流程]

1、实验前标准品、试剂及样本的准备；

2、加样（标准品及样本）100μL，37^oC孵育2小时；

3、加检测溶液A100μL，37^oC孵育1小时；

4、洗板3次；

5、加检测溶液B100μL，37^oC孵育30分钟；

6、洗板5次；

7、加TMB底物90μL，37^oC孵育15－25分钟；

8、加终止液50μL，立即450nm读数。

[说明]

1、 由于现有条件及科学技术水平尚不能对所有供货商提供的所有原料进行全面的鉴定与分析，本产品可能存在一定的质量技术风险。

2、 zui终的实验结果与试剂的有效性、实验者的相关操作以及当时的实验环境密切相关，请务必准备充足的标本备份。

3、 不同批次的同一产品可能会有少许差别，如：检测限、灵敏度以及显色时间等，请依据试剂盒内说明书进行实验操作，电子版说明书仅作参考。

4、 只有全部使用本试剂盒配套试剂才能保证检测效果，不能混用其他制造商的产品。只有严格遵守本试剂盒的实验说明才会得到*的检测结果。

5、 在储存及温育过程中避免将试剂暴露在强光中。所有试剂瓶盖须盖紧以防止蒸发和微生物的污染，因为蛋白水解酶的干扰将导致出现错误的结果。

6、 刚开启的酶联板孔中可能会有少许水样物质，此为正常现象，不会对实验结果造成任何影响。请勿提前将酶标板从包装袋里拿出。

7、 由于操作者不熟练、操作失误或读数仪程序选用错误等有可能会导致错误结果的产生。请使用者使用该产品前仔细阅读说明书，调试好酶标仪，请使用配备有450±10nm滤光片的酶标仪，且该酶标仪测量范围在0.001-3.000 O.D.或以上。

对ELISA操作不熟悉的可以参照视频

8、 同一使用者在使用同一产品时，如不同时间订购，也可能会因不同批次的少量差异产生不同结果，因此建议使用者在每次使用前均进行预实验。

9、 试剂盒在出厂前均经过严格检测，但由于运输条件及各实验室条件差异，可能会造成实验结果与出厂结果不一致或不同批次试剂盒批间差大的情况，Uscn,Inc.会根据实际情况酌情处理。

10、本试剂盒未与其他厂家同类试剂盒或不同方法检测同一目的蛋白的产品做对比，平行检测可能会存在检测结果不一致的情况。

11、本试剂盒有效期：六个月。

12、本操作说明同样适用于48T试剂盒，但48T试剂盒所有试剂减半。

[警告]

本试剂盒中使用了稀硫酸作为终止液，其具有轻微腐蚀性，使用时应避免接触衣物或眼、手等皮肤暴露部位。