第九章 蛋白显色
酶促反应比同位素安全且快速，已经成为 Western Blot 的主流检测方法。酶促反应可以搭配不同的底物从而实现不同的显色方法：化学发光和底物显色，前者灵敏度很高，已经达到皮克级别，甚至还有飞克级别的，灵敏度超过了同位素；而后者由于直接显色而操作简便且成本低。
大家zui为熟悉熟悉当数辣根过氧化物酶 HRP（Horseradish Peroxidase）和碱性磷酸酶 AP（AlkalinePhosphatase），此外还有比较少见的葡萄糖氧化酶（Glucose Oxidase）和 β 半乳糖苷酶（β-Galactosidase）。在酶连抗体中使用的酶通常是碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。碱性磷酸酶可以将无色的底物 5-溴-4-氯吲哚磷酸盐（BCIP）转化为蓝色的产物；而辣根过氧化物酶可以以H2O2为底物，将 3-氨基-9-乙基咔唑氧化成褐色产物或将 4-氯萘酚氧化成蓝色产物。另一种检测辣根过氧化物酶的方法是用增强化学发光法，辣根过氧化物酶在H2O2存在下，氧化化学发光物质鲁米诺（luminol，氨基苯二酰一肼）并发光，在化学增强剂存在下光强度可以增大 1000 倍，通过将印迹放在照相底片上感光就可以检测辣根过氧化物酶的存在。
① HRP 标记二抗用 DAB 显色，按顺序依次将 DAB 三种剂各取 3 滴于 5 ml 蒸馏水中，避光混匀，将膜加入显色液中避光显色 5-15min 终止反应，对照 Marker 记录实验结果，将 NC 膜晾干扫描保存。HRP的生色底物显色有 DAB、4-CN、CN/DAB、AEC 和 TMB 等。
HRP 化学发光反应底物主要有 Luminol、ECL 和 SuperSignal 系列。可直接从公司购买试剂盒，操作比较简单，原理如下（二抗用 HRP 标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到 HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。
② AP显色底物生成的产物主要是蓝紫色，成像性好容易拍照。 AP的底物显然更稳定，不像HRP那样需要新鲜 配制 的 H2O2一 类 的不稳 定成 分，作 为试 剂盒可 以保 存时间 更长 。常用显 色底物 的是BCIP(5-Bromo-4-Chloro-3 ’ -Indolyphosphate p-Toluidine Salt) ， NBT (Nitro-Blue TetrazoliumChloride)和INT。
③ 底物发光法：将两种显色底物 1:1 等体积混合后将其覆盖在膜表面使其均匀，用玻璃胶片把膜包起来，马上在暗室中将 X 光片覆盖在膜的上面（时间根据光的亮度来衡量），显影、定影。（注意：发光法检测的时候曝光时间要恰到好处，过短会导致曝光不*，影响条带亮度，过长会导致荧光信号衰弱，也会使背景颜色加深）除了酶连二抗作为指示剂，也可以使用其它指示剂，比如：荧光素异硫氰酸盐标记的二抗（可通过紫外灯产生荧光）；生物素结合的二抗等等。
关于磷酸化蛋白检测的注意事项：
① 保持待测蛋白处于磷酸化状态，在标本提取液中加入足够的磷酸酶抑制剂（NaF，可以防止去磷酸化），并将标本时刻保持在冰浴中。
② 使用 5%的 BSA 作为封闭试剂，不能使用脱脂奶粉（因为脱脂奶粉中含有酪蛋白，会出现很高的背景）。
③ 请谨记蛋白的磷酸化是需要诱导的，当信号低或者无信号时有可能是磷酸化诱导不充分！确保使用阳性对照。
