冻存温度
冷冻速度也就是降温的速度，它与冷冻效果直接相关。
Morris认为在冷冻过程中生物物理作用比生物化学作用更重要。冷冻速度、细胞收缩引起细胞膜和细胞器的变化是造成损伤的主要因素目。冷冻速度不同，细胞内水分向细胞外流动的情况也会不同。如果冷冻速度过慢，细胞内水分外渗多，细胞脱水，体积缩小，同时细胞内溶质浓度增高，细胞内不发生结冰；冷冻速度过快，细胞内水分没有足够时间外渗，随着温度的下降，细胞内会发生结冰；如果冷冻速度非常快，细胞内形成的冰晶反而非常小或不结冰而呈玻璃状凝固(玻璃化冷冻)。
1937年，Luyet证实液体的凝固可分为两种形式：一种是晶体化，液体中的分子呈有序的排列；另一种为非晶体化即玻璃化，液体中的分子呈无序排列，保持未凝固前的状态。故从细胞存活角度来说玻璃化冷冻是zui为理想的冻存方法。细胞内外呈玻璃化凝固。无冰晶形成或形成很小的冰晶，对细胞膜和细胞器不造成破坏；细胞也不会在高浓度溶质的溶液中因暴露时间过长而受损。
不同细胞的zui适冷冻速度不同，主要取决于水分渗透过程是否与降温速度相匹配；同时还取决于细胞的表面积与体积之比，以及细胞膜的渗透率。一般来说。小细胞(如红细胞等)对水通透性强，适用于快冻，*冷冻速率较高，可达103摄氏度/min或更高；相反大的细胞或组织，如直径100μm以上的胚胎，对水的通透性弱，则适于慢冻。
此外，*冷冻速度还受是否应用防冻剂、防冻剂的含量以及培养的细胞所处的状态等多方面的因素影响。目前被普遍接受的是皮肤的低温保存中采用慢冻快复温，一般认为降温速率以1~5摄氏度/min为*。
保存温度：
冷冻保存温度是指长久保存细胞的超低温度，在此温度下，细胞生化反应极其缓慢甚至停止。经过长期保存的细胞和组织在复苏后仍能保存正常的结构和功能。
冷冻保存温度可以随着不同的细胞和生物体以及不同的冷冻保存方法而不同。液氮温度(-196℃)是目前*冷冻保存温度。在-196℃时，细胞生命活动几乎停止，但复苏后细胞结构和功能完好。应用-70~80℃条件冷冻保存细胞，短期内对细胞活性无明显影响，但随着冻存时间延长，细胞存活率明显降低。在0～40℃范围内保存细胞效果不佳。
细胞复苏：
复温速度是指在细胞复苏时温度升高的速度。冷冻保存体外培养物，除了必须有*的冷冻速度、合适的冷冻保护剂和冻存温度外，在复苏时也需要有*的复温速度，这样才能保证zui终得*冷冻保存效果。与冷冻过程相比，复温过程的研究显得薄弱得多。
复温速度不当同样会造成细胞损伤，降低冻存细胞存活率。其损伤发生非常快，持续时间也很短，原因可能有多方面。Mackenzie和Bank通过对酵母细胞的冷冻研究发现，冷冻过程中胞内形成的冰晶并未对细胞造成致命的损伤，反而是在复温过程中，复温到-40℃或者更高的温度时，细胞内会重新形成较大冰晶而造成细胞的致命损伤。常规的做法是，在37℃水浴中，于1—2 min内完成复温，也就是通常采用的快速复苏。
因此，*复温速率与*冷冻速率对保证获得*冻存效果同等重要。
冻存保护剂：
冻存保护剂(Cryoprotectant)是指可以保护细胞免受冷冻损伤的物质(常为溶液)。细胞悬液中加入冷冻保护剂可保护细胞免受溶液损伤和冰晶损伤。冷冻保护剂同溶液中的水分子结合，发生水合作用，弱化水的结晶过程使溶液的粘性增加从而减少冰晶的形成．同时冷冻保护剂可以通过在细胞内外维持一定的摩尔浓度，降低细胞内外未结冰溶液中电解质的浓度，使细胞免受溶质的损伤。
冷冻保护剂根据其是否穿透细胞膜可分为渗透性和非渗透性两类。
渗透性冷冻保护剂多是一些小分子物质，可以透过细胞膜渗透到细胞内。该类保护剂主要包括二甲基亚砜(Dimethyl Sulfoxide，DMSO)、甘油、乙二醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇等。其保护机制是在细胞冷冻悬液*凝固之前，渗透到细胞内，在细胞内外产生一定的摩尔浓度，降低细胞内外未结冰溶液中电解质的浓度，从而保护细胞免受高浓度电解质的损伤同时。细胞内水分也不会过分外渗，避免了细胞过分脱水皱缩。在使用该类冷冻保护剂时，需要一定时间进行预冷，在细胞内外达到平衡以起到充分的保护作用。目前使用较多的是DMSO、甘油、乙二醇和丙二醇等。
非渗透性冷冻保护剂一般是些大分子物质，不能渗透到细胞内。
不同的冷冻保护剂有不同的优缺点。目前的趋势是联合使用两种以上冷冻保护剂组合。由于许多冷冻保护剂在低温条件下保护细胞，在常温下对细胞有害。故在细胞复温后要及时清除冷冻保护剂。
