单细胞传代方法

介绍
多能性干细胞(PSCs)是基础研究和应用的基本工
具，包括再生治疗、药物开发和毒理学评估。尽管
无滋养层系统的问世大大提升了PSCs的可扩展性，
但细胞团块传代技术(如使用分散酶、胶原酶或EDTA
等试剂)通常不适用于下游实验应用，如高通量筛
选、基因编辑和定向分化。
单细胞培养是干细胞培养研究中的标准和惯常方
法。通过利用单细胞解离传代技术，科学家们能够
获得值得信赖的细胞用于下游应用和克隆筛选、成
像和细胞分选比较，也可用于对细胞复苏和细胞数
量要求很高的悬浮培养。Gibco
?
 RevitaCell?添加剂
可与Essential 8?培养基结合使用，用于单细胞传
代时可实现zui大的细胞存活率。与其他商品化的配
方不同，RevitaCell?添加剂包括rho相关蛋白激酶
(ROCK)抑制剂，其选择性优于传统的ROCK抑制剂
(如Y-27632和thiazovivin)，可与包含抗氧化剂和具
有自由基清除剂特性的分子结合使用。这种混合物
可以zui大程度地降低单细胞传代的影响，大大提升
细胞总存活率，有助于确保提升下游实验中细胞供
应的稳定性和存活率。
材料与方法
PSC培养和扩增
在无滋养层条件下，使用Essential 8?培养基在玻
连蛋白(VTN-N)包被的培养板中培养H9人胚胎干细
胞(hESCs)和人诱导性多能干细胞(使用episomal附
着体载体生成的hiPSCs)。每3至5天传代hiPSCs一
次 ，达到~80%汇合)。
使用TrypLE? Select酶或StemPro
?
 Accutase
?
细胞
消化液进行hiPSCs单细胞传代
对于单细胞传代实验(参考图1中的工作流程)，使
用不含钙和镁的DPBS冲洗细胞，然后使用预热的
TrypLE? Select酶(1 mL每6孔板的一个孔)进行处
理。将细胞置于37°C、5% CO2培养箱中孵育5分
钟。孵育后，使用Pipetman
?
 P1000吹吸细胞5至10
次，以获得单个细胞。然后将细胞悬液转移至
含有3 mL新鲜Essential 8?培养基的锥形管内，稀
释消化液，以200 x g离心4分钟。吸弃培养基，小
心不要搅动细胞沉淀，在添加了1X RevitaCell?添
加剂的Essential 8?培养基中复苏并培养(细胞接种
密度如图1所示)分种后18-24小时细胞，然后每天仅
补充Essential 8?培养基进行培养