小胶质细胞原代培养

小胶质细胞原代培养 
时间：15天  
试剂： 
出生后1-2天的新生C57BL/6小鼠（斯莱克）            9只

DF12培养基（GIBCO，C11330）                      90ml

胎牛血清（FBS）(10%) （GIBCO，10099）              5ml

解剖液                                             50ml

1 x胰蛋白酶(0.25%)（Gibco，25200-072）             10ml

10mg/ml DNA酶                                     70ul

75%酒精                                            200ml  

器材： 
酒精棉球1杯（20个） 
装有75%酒精的敞口容器1个 
原代解剖器械盒（2把中号镊子，1把中号剪刀，1把眼科弯镊，1把眼科直镊，1把眼科剪，2把显微镊，1把显微剪） 洗净消毒后小瓶3个（带盖子） 小平皿4个（带盖子） 解剖镜+冷光源 
消毒后卫生纸12张 
1ml移液器1把+枪头1盒 10ml玻璃离心管3个 T75大培养瓶3个 消毒后吸管3根 
紫外消毒白大褂1件  
试剂配制： 
中和胰蛋白酶用的*培养基：DF12 45ml和FBS 5ml混合而成。 
步骤： 
1、取出生后1-2天的新生C57BL/6小鼠9只，泡在酒精中消毒后取出大脑，置于放有解剖液的小平皿中，在解剖镜下剥离血管膜 
关键：注意无菌操作；剥离血管膜要* 
2、将剥离完血管膜的大脑放入预置有1ml解剖液的青霉素小瓶中，用显微剪剪碎（<1mm3） 关键：剪碎效果较用枪头吹吸好，要剪得尽量碎 
3、加入两滴DNA酶和1ml胰酶（胰酶终浓度为0.125%），于37℃孵箱中孵育15分钟 关键：每5分钟可略微晃动一下以助于消化 
4、取出小瓶，将液体倒入离心管中，加5ml*培养基，离心（1000rpm*5分钟），取出离心管，吸出上清，再加入5ml无血清培养基，吹打后静置沉降20分钟，将上清用吸管吸出，加入T 75大培养瓶中，放入孵箱中培养，3小时后换液。 
关键：静置沉降后吸取上清液时吸取中层（zui上层和zui下层均不要），避免杂质吸入培养瓶中 

5、每7天换一次液，培养14天后取出，在摇床中培养6小时（200rpm ，37o

C），取上清加入离心管中离心（400g*8分钟），弃上清，加入4ml无血清培养基轻轻吹打重悬，均匀滴加于24孔培养板的*4个孔中，于孵箱中培养半小时使小胶质细胞贴壁，取出，吸出上清，再每个孔加1ml培养基，即得较纯净的小胶质细胞。 
关键：小胶质细胞贴壁后吸取上清当轻微吹打，以使杂细胞悬浮吸去