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一、实验原理

细胞培养可分为原代培养和传代培养。直接从体内获取的组织细胞进行培养为原代培养；当原代培养的细胞增殖达到一定密度后，则需要做再培养， 即将培养的细胞分散后，从一个容器以1：2或其他比率转移到另一个或几个容器中扩大培养，为传代培养，传代培养的累积次数就是细胞的代数。

细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以zui大限度的保存细胞活力。目前细胞冻存多采用甘油或DMSO作保护剂，这两种物质能提高 细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。复苏细胞应采用快速融化的方 法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。

二、实验方法

材料：

小鼠，生理盐水，100ml灭菌烧杯，15ml离心管，培养皿，滴管，无菌镊子、剪刀，筛网，泡沫板，大头针，酒精灯，培养瓶，培养 液，PBS，0.25%胰酶，超净工作台、二氧化碳培养箱、倒置显微镜，显微镜，计数板，离心机，恒温水浴箱，冰箱（4℃、-20℃、-70℃），液氮 罐，冻存管，冻存液，废液缸等。

方法：（1）原代培养（2）传代培养（3）冻存（4）复苏

三、实验结果计算

1.一只小鼠可获得（1～2.5）×108个脾细胞。

2.细胞接种后一般几小时内就能贴壁，并开始生长，如接种的细胞密度适宜，5天到一周即可形成单层。

3.一般情况，传代后的细胞在2小时左右就能附着在培养瓶壁上，2～4天就可在瓶内形成单层，需要再次进行传代。

四、注意事项

1.取材要求新鲜，无菌，解剖小鼠时，注意不要损伤脾脏及其周围的脏器，尤其是肠道等，防止污染脾脏。

2.冲洗脾脏时要尽量洗净血污，去除无用组织，并要防止组织干燥。

3.碾磨后及时用清水冲洗筛网，防止组织、细胞阻塞网孔。

4.计数前，注意吸尽平皿里的细胞，充分混匀，使细胞分散成单个细胞。

5.实验操作应在操作台*无菌区域内进行，勿在边缘非无菌区域操作。

6.金属器械不能在火焰中烧的时间过长，烧过的金属镊要待冷却后才能挟取组织，以免造成组织损伤。

7.另外胶塞过火焰时也不能时间长，以免烧焦产生有毒气体，危害培养细胞。

8.吸取过营养液后的吸管不能再用火焰烧灼，因残留在吸管头中营养液能烧焦形成炭膜，再用时会把有害物带入营养液中。

9.不能用手触及已消毒器皿瓶口、瓶塞内部，吸管前部等所有可能与细胞接触的部分，如已接触，要用火焰烧灼消毒或取备品更换。

10.开启、关闭长有细胞的培养瓶时，火焰灭菌时间要短。防止因温度过高烧死细胞。

11.换液时倾倒废液，瓶口不能接触废液缸，速度不能过快，防止废液四溅。

12.吹打细胞时，要注意边角的细胞是否吹打下来。

13.手或相对较脏的物品不能经过开放的瓶口上，即不可以在开放容器上方操作。

14.每次操作只处理一株细胞，以免造成细胞交叉污染。

15.注意自身的安全，对于来自人源性或病毒感染的细胞株应特别小心。操作过程中，应避免引起气溶胶的产生，小心有毒性试剂例如DMSO，并避免尖锐物品伤人等。

16.从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于冻存，但为对数生长期细胞。在冻存前一天换一次培养液。

17.将冻存管放入液氮容器或从中取出时，要做好防护工作，以免冻伤。

18.冻存和复苏用新配制的培养液。