浅谈畜牧兽医站实验室常规ELISA检测操作注意事项

1 ELISA的基本原理与类型 
ELISA是一种免疫测定技术。免疫测定技术是应用免疫学技术测定标本的方法。在临床检验中主要通过抗原抗体反应检测体液中的抗体或抗原性物质。ELISA既可用于测定抗体，也可用于检测抗原。根据检测目的和操作步骤的不同，有以下四种类型的常用方法：直接法、间接法、双抗体夹心法、竞争法。 
2 ELISA试验的特点 
ELISA试验主要有以下几个特点：①灵敏度高、特异性强；②方法快速、简便；③重复性好；④自动化程度高，适合批量标准化检测；⑤安全可靠。 
3 ELISA试验的操作要领[1，2] 
3.1 样品的采取和保存 
3.1.1 样品种类 体液、组织、分泌物和排泄物。 
3.1.2 样品要求 新鲜、无溶血、无沉淀、均匀。 
3.1.3 样品采取与保存 尽量避免溶血；血清标本的制备：非抗凝自然凝固1～2 h，3 000 r/min离心15 min；血浆标本的制备：使用含有抗凝剂的采血管采血，颠倒混匀放置一段时间后，3 000 r/min离心15 min；标本宜在新鲜时检测，若5 d内检测，可使用冰箱于2～8 ℃保存，超过1周时间测定，应于-20 ℃低温冻存；反复冻溶会使抗体效价跌落，所以测抗体的血清标本如需保存做多次检测，宜少量分装冻存。 
3.2 试剂的准备 
严格按要求准备试剂；使用新制的蒸馏水或去离子水；自配缓冲液应用pH计测量较正；冷藏试剂应平衡至室温后使用；试剂盒中暂时不用的部分应及时放回冰箱。 
3.3 加样 
尽量使用多道移液器；微量加样器应注意保养并定期校正；加样前应使溶液充分混匀，并将液体加在孔底，避免加在孔壁上部，注意不可出现气泡。加样时避免样本溅出，如有样本溅出孔外时，应用吸水纸轻轻拭干，并做相应记录。加样后微孔板应及时温育，尽量缩短加样后温育前的等待时间。 
3.4 保温孵育 
3.4.1 温度 37 ℃、室温（20～25℃）和4 ℃；温度要恒定、准确。 
3.4.2 保温方式 水浴保温时，ELISA板底应贴着水面，加盖避免蒸发；保温箱保温时为避免蒸发，用湿盒或用塑料贴封纸覆盖板孔；反应板不宜叠放。 
3.5 洗涤 
3.5.1 目的 清除残留在板孔中未结合的物质；清除非特异吸附于固相载体的干扰物。 
3.5.2 要求 洗涤要充分；排净；避免干燥。 
3.6 显色和比色 
3.6.1 显色 显色是酶促反应，温度和时间应力求准确；显色反应应避光进行。 
3.6.2 比色 酶标板的放置要正确；要选用产物的敏感吸收波长；以空白孔调零或双波长式测读可减少误差。 
4 ELISA试验的常见问题及分析 
ELISA操作是需要非常细心的工作。操作者在进行ELISA操作前应该对试验有充分的了解，并对预期结果十分清楚。实验室ELISA 试验失败的原因有10%左右是由于水质量引起的，另外90%则是操作上的失误引起的，包括未意识到的操作失误，或者明知操作原则但想偷懒而未按正确要求操作；另外，还有少量失败案例是由于设备的管理不当或设备状况太差引起的[3]。