硝基四氮唑蓝染色法、结晶紫染色法、固紫染色法

硝基四氮唑蓝染色法、结晶紫染色法、固紫染色法、及Ziehl-Nidlsen染色法

硝基四氮唑蓝染色法：

感染引起细胞内还原性辅酶I的活力增强，在细胞内酶的作用部位，导致无色的四氮唑蓝（nitroblue tetrazoliun test,NBT)被还原为不溶于水的蓝色沉淀物。这种大块状蓝色沉淀物仅见于成熟和幼稚的嗜中性粒细胞胞浆中。文献报道在细菌和真菌感染时，嗜中性粒细胞百分率升高（＞12%），康复期恢复正常。而病毒和结合感染时大多阴性。NBT测定还可以作为疾病病程和抗生素疗效指标。

1、操作步骤如下

①将脑脊液与NBT工作液各0.5ml混合后，置于脑脊液细胞玻片离心沉淀器中。

②37℃水浴箱中孵育15min；

③取出脑脊液细胞沉淀器，离心后取下玻片，空气干燥；

④MGG染色

2、主要试剂的制备

①磷酸缓冲液（0.15mol/L);Na2HPO41.52g， KH2PO4 0.496g，加入9g/L NaCl中之100ml，溶解后校正PH为7.2.

②NBT染液：临用时将2g/L NBT生理盐水溶液与上液等量混合即成。

结晶紫染色法：

结晶紫染色法操作简单，主染核，变性细胞染色较淡。其原理是结晶紫染色可通过细胞的特定摄生法而选择性地被细胞核吸收，死亡的细胞几乎不吸收结晶紫燃料。

具体操作步骤：

①甲醇固定1min

②0.1%结晶紫水溶液3-5min

③96%乙醇分化2-3

固紫染色法：

固紫染色即（Gram染色。固紫阳性菌（链球菌等）染成深蓝色，而奈瑟菌属如脑膜炎双球菌，假单胞菌如绿脓杆菌、肠道杆菌等则成阴性。

操作步骤

①干片于火焰上稍稍固定

②浸入结晶紫溶液中0.5-1min

③流水冲洗；

④浸入Luqol浓碘溶液中1min

⑤96%乙醇溶液中脱色

⑥流水冲洗

⑦浸入品红溶液中1min

⑧流水冲洗待干。

溶液的制备

①Hucker结晶紫溶液。结晶紫200mg溶于蒸馏水*90ml内，再加0.1mol硼酸及硼酸盐缓冲液10ml（PH9.0）。此液需新鲜配置，不得过页。

②Luqol浓碘溶液。碘化钾2g溶于蒸馏水10ml内，加碘1g，蒸馏水加至300ml。

③品红溶液。蒸馏水100ml中韩品红200mg。

Ziehl-Nielsen染色法：

抗酸染色（acid-fast stain）1982年由Ziehl-Nielsen*，因此又称为萋-纳氏（Ziehl-Nielsen）染色，主要针对抗酸杆菌。抗酸杆菌属分枝杆菌，由于菌体壁上含有大量的脂类，一般染色不易着色，但能与碱性品红染液结合成复合物，可抵抗算脱色作用，成红色，背景蓝色，对比清晰。

步骤如下：

①图片干燥后，火焰或乙醇乙mi固定：

②滴加石碳酸付红液于玻片上，火焰上徐徐加热至有蒸汽出现，切不可沸腾，5min；

③崎岖石碳酸液，流水冲洗；

④浸入3%的盐酸酒精中摇荡至无红色脱落为止；

⑤流水冲洗；

⑥碱性美蓝溶液负染30s

⑦流水冲洗，干后镜检。

溶液的制备：

①石碳酸品红溶液：碱性品红0.5g、无水乙醇10ml、石碳酸5g、蒸馏水90ml（碱性品红乙醇饱和溶液10ml，5%石碳酸溶液90ml）

②盐酸究竟：浓盐酸3ml，95%乙醇97ml

③美兰液；95%乙醇饱和美兰液30ml加入10%氢氧化钾0.1ml，蒸馏水100ml。

注意事项：

①抗酸染色用于细胞学图片上时，可以适当增加标本的厚度以提高检出率。

②细胞学图片以火焰固定为好。

③品红加热不宜过猛过长。因为脑脊液中的结核杆菌比较赤裸，不像痰中结核杆菌包埋在粘液中，温度过高可使细菌炸裂和难于辨认。

在做北京染色时（即苏木精染色）尽量浅染，以免掩盖红色杆菌色调，影响检出效果。

⑤该法常用石碳酸付红染液覆盖标本后加温，冒蒸汽开始计时，随时添加染液，保持湿润，防止干燥，知道5min位置。染液用量多，操作复杂，并容易流到玻片外，沾污水或试验台。针对传统的抗酸染色发的不足，许多学者对染色方法进行了改进，改良法将石碳酸付红染色液先在沸水浴中加温10min，在进行染色，结果尚可，可避免以上不足。