IOSE80细胞 传代和换液

贴壁生长的IOSE80细胞是用弯口培养瓶培养，培养瓶平放（瓶口向上翘），细胞就贴在瓶底内壁一层生长。瓶底空间有限，当细胞在瓶底生长铺满一层时，由于接触抑制，细胞会停止分裂而进入老化凋亡的状态。理论上将瓶底平面空间扩大，就能让细胞有更大的空间继续生长。在实际操作上，就是把一个瓶的贴壁细胞从瓶底内壁“取下来”，再稀释分装到X个新的培养瓶，这就相当于把原来的面积扩大了X倍。就是我们习惯上说的“1传X”。所谓“传代”就是这个意思，以细胞分裂来说，这样的“传代”并不是指细胞由一个变成两个，而是已经经过了很多代了。“取下来”的意思不是生刮硬掰，而是用胰蛋

白酶消化液。细胞相互贴住或与瓶壁贴住的机理就是靠细胞表面的蛋白。胰蛋白酶能水解这种蛋白而破坏细胞的粘连，从而消散成团细胞成单个细胞悬液。

操作上：进入无菌室，酒精擦手消毒，无菌风吹干双手，点燃台面的酒精灯，培养液和胰酶放到超净台上，打开塞子备用。从培养箱中取出一瓶细胞，准备传代。先准备要用的移液管。一般我是用四根/瓶，两根5ml的，两根2ml的。*根移液管（5ml）是用来吸掉培养瓶内旧的培养液的，废液放到废液缸。然后用一根新的管（2ml）吸取一点胰酶，滴7～8d到瓶中。这时由于还残留有旧的培养液，而培养液中的血清是会终止胰酶的消化作用的，所以*次加入的胰酶实际上是清洗作用，当然用PBSbuffer也一样，只是我贪方便。摇动瓶子，清洗完后用原来加胰酶的管把液体吸走。用第三根管（2ml）再吸胰酶，同样滴加7～8d入瓶，这时胰酶就是消化用的。拧上盖子，平放，让胰酶刚刚覆盖细胞薄薄一层进行消化。时间不能长，1～2分钟就应该可以，摇动培养瓶，看底下白色的一层细胞是否能摇下来，细胞散落随液体流到瓶底，证明消化成功。准备几个空的培养瓶，用第四根移液管（5ml）吸取一定的新鲜培养液加到细胞消化好的培养瓶中，吹打几次，让细胞散开成单个细胞悬液，分装到多个培养瓶中。拧上盖子（不要拧紧，让二氧化碳进入），放到培养箱中进行培养。

换液就是去掉旧的培养液，换入新鲜的培养液，操作如上，就是不用胰酶消化。

这过程看似简单，但却有很多要注意的细节。

首先，操作尽量往里。就是说尽量伸进去超净工作台一点，因为越是接近工作台边缘，细菌飘进的机会就增加，哪怕是有无菌风。

第二，装培养液的瓶子和装胰酶的试管打开塞子前要用酒精擦，火上烤干再打开。开口后，开口向操作者倾斜放在架子上。这样你吸取液体的时候就不用一只手拿着瓶子（试管）了。

第三，永远不能在开口正上方操作。意思就是说你吸取液体时，培养液瓶或胰酶试管开口保持倾斜，移液管也是倾斜插入瓶内。如果开口就垂直向上，你也必须垂直插入移液管，那么手上或吸耳球上就有可能有一两个细菌垂直掉进瓶内。还有，取器材时，手要“绕弯”避免在瓶子开口上方空中经过。

第四，吸放一次完成。比如吸掉旧的培养液时一次吸完。如果液体比较多，要分几次吸时，移液管口不能接触废液缸。吸取新鲜培养液到培养瓶时，管口也不能接触瓶子，要在瓶口吹进去。因为如果接触到瓶子，管口就可能带有细胞，如果再放到培养液瓶里面去继续吸的话，培养液就会被细胞污染。当然，吸够新鲜培养液后还要吹打，这时就可以接触，只要你不再吸培养液的话。

第五，移液管要套上一个吸耳球，套球时要注意，左手拿管，右手拿球套上去。关键是左手拿管的位置。不能拿管口部分，应该尽量靠上。

第六，一般移液管使用前要在酒精灯上烤一下，就是所谓“过火”。但切记不能烤得太烫，稍微过一下就行了。

如何判断该传代还是换液？

首先，培养液中的红色是因为加了甲基红，一般刚配好的时候是偏淡的血红色的。4℃放置一段时间颜色会加深，这是正常的。放到培养箱中因为二氧化碳的作用会变成橙偏红色。细胞生长会排出偏酸的代谢废物而使培养液颜色向黄色转变，如果发现培养液颜色偏黄了，就说明细胞生长旺盛，是时候要传代/换液了。然后是镜检。一般我们会以“满瓶率”表示。就是细胞铺满培养瓶底壁的多少。刚开始时你必须每天观察，了解细胞生长的速度。细胞刚开始时不多的话，生长可能就会比较慢，但细胞多起来的话生长就会加快。这符合对数生长的规律。一般生长快的细胞铺满70％以上就要传代处理了。这需要一定的经验判断。

如何判断“1传X”的“X”？

参考书上是写通过细胞计数调一定浓度的细胞悬液接种到几个培养瓶……我觉得比较麻烦，所以我是通过镜检观察“满瓶率”再加上经验来判断的。我觉得首先是你要了解细胞生长的速度，根据你实验的时间表定一个周期。传代时控制细胞量以配合你的时间表。例如，我培养的细胞生长较旺盛，所以我自己是定了3天为一个周期。一般70％满的细胞就1传3，三天后刚好又长到70％满多一点。每次多一点，到了三四次就会由原来的70％满变成90％满，这时就1传5或6，控制下来。