酶切反应注意事项

酶切反应注意事项

限制酶价格昂贵，操作时应注意下列原则

1. 许多购得限制酶为浓缩液，通常1ul（约10单位）酶液足以在1小时内切割10ugDNA。当需要从观众取出少量酶液时，可用一次性移液器吸头稍稍接触页面，这样可取出少至0.1ul的酶液。另一种方法是将一根孔径很小的塑料管（Icm长）套在1ul的微量注射器上，然后吸取酶液。浓缩的酶液可在使用前1X反应缓冲液稀释，但绝不能用水稀释，以免变性失活。
2. 限制酶在含50%甘油的缓冲液中，-20℃下可稳定保存。在家酶反应之前，反应管中应预先加入除了酶以外的所有其他试剂。从冰箱中取出酶后，立即放于冰上。每次取酶都必须使用无菌的新吸头，如果酶被DNA或其他酶污染，则费钱耗时，影响工作。不鞥呢让酶在冰箱外放置过久，更不能让其温度大于0℃，应尽快操作，用完后立即将酶放回冰箱。
3. 酶应分装成小份尽量避免反复冻融。
4. 反应中尽肯能少加水，使反应体积保持zui小，但必须保证酶液的体积不超过总反应体积的10%，否则酶液中的甘油会抑制酶的活性。
5. 通常延长反应时间可以减少酶的用量，当切割大量DNA时，这样做比较节约。
6. 当需在许多管DNA样品中用同一种酶时，应计算所需酶的总量（包括略微增加一点酶量以弥补转移过程中的损失），然后取出酶，用适当的1X酶反应缓冲液稀释，再将酶稀释液分别加至各个反应管中。如果DNA需要用两种或更多种酶切割，而某一种缓冲液对两种酶都很适合，则反映可同时进行。如果需要不同的缓冲液，则有两种办法①采用下表中的三种缓冲液，先用适合低离子浓度缓冲液的酶切割DNA，然后加入适量的NaCI调节缓冲液中的盐浓度并加入第二种酶。②使用表二中的适合于所有限制酶KGB（谷氨酸钾缓冲液）通过缓冲液
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