琼脂免疫操作方法

（一）材料与试剂

1．琼脂粉

2．平皿

3．打孔器

4．生理盐水或其他缓冲液，可加1/万的硫柳汞或叠氮钠防腐。抗原

（二）操作方法

1．称取一定量的琼脂粉，按1%左右（0.8％～1.5%）的比例加入生理盐水或缓冲液，水浴煮沸融化20min。

2．将融化的琼脂倒入平皿内，使厚度2mm～3mm。自然冷却。

3．根据要求（孔径即孔的直径，孔距即两孔圆心之间的距离，包括两孔的半径）按模板打孔。也可直接用组合打孔器打孔。现在一般多打成梅花形孔图。

4．挑出孔内琼脂，注意不要挑破孔缘。

5．在火焰上缓缓加热，使孔底边缘的琼脂少许熔化，以封底，以免加样后液体从孔底渗漏。

6．以毛细滴管吸取样品加入孔内，注意不要产生气泡，以加满为度。加少了，影响反应程度，加多了，易溢出，也影响反应结果。

7．加毕后，盖上平皿盖，将平皿翻过来，置湿盘中，37℃自由扩散24h～48h。

（三）结果判定

1．用以检测抗原或比较抗原差异时，将抗血清置中心孔，将待测抗原或需比较的抗原置于周围相邻孔。若出现沉淀带*融合，证明为同种抗原；若二者有部分相连，表明二者有共同抗原决定簇；若二条沉淀线相互交叉，说明二者抗原*不同。

2．用做血清流行病学调查时，将标准抗原置中心孔，周围1、3、5孔加标准阳性血清，2、4、6孔分别加待检血清。待检孔与阳性孔出现的沉淀带*融合者判为阳性。待检血清无沉淀带或所出现的沉淀带与阳性对照的沉淀带*交叉者判为阴性。待检孔虽未出现沉淀带，但两阳性孔的沉淀带在接近待检孔时，两端均内向有所弯曲者判弱阳性。若仅一端有所弯曲，另一端仍为直线者，判为可疑，需重检。重检时，可加大检样的量。

检样孔无沉淀带，但两侧阳性孔的沉淀带在接近检样孔时变得模糊、消失，可能为待检血清中抗体浓度过大，致使沉淀带溶解，可将样品稀释后重检。

3．用以检测的抗血清的效价时，将抗原置中心孔，抗血清倍比稀释后置周围孔，以出现沉淀带的血清zui高稀释倍数为该抗血清的琼扩效价。

（四）注意事项

1．不规则的沉淀线可能是加样过满溢出、孔型不规则、边缘开裂、孔底渗漏、孵育时没放水平、扩散时琼脂变干燥、温度过高蛋白质变性或未加防腐剂导致细菌污染等所致。

2．抗原抗体的比例与沉淀带的位置、清晰度有关。如抗原过多，沉淀带向抗体孔偏移和增厚，反之亦然。可用不同稀释度的反应液试验后调节。