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琼脂免疫操作方法

上海佳和生物科技有限公司

2016/3/2 11:23:10

(一)材料与试剂

1.琼脂粉

2.平皿

3.打孔器

4.生理盐水或其他缓冲液,可加1/万的硫柳汞或叠氮钠防腐。抗原

(二)操作方法

1.称取一定量的琼脂粉,按1%左右(0.8%~1.5%)的比例加入生理盐水或缓冲液,水浴煮沸融化20min。

2.将融化的琼脂倒入平皿内,使厚度2mm~3mm。自然冷却。

3.根据要求(孔径即孔的直径,孔距即两孔圆心之间的距离,包括两孔的半径)按模板打孔。也可直接用组合打孔器打孔。现在一般多打成梅花形孔图。

4.挑出孔内琼脂,注意不要挑破孔缘。

5.在火焰上缓缓加热,使孔底边缘的琼脂少许熔化,以封底,以免加样后液体从孔底渗漏。

6.以毛细滴管吸取样品加入孔内,注意不要产生气泡,以加满为度。加少了,影响反应程度,加多了,易溢出,也影响反应结果。

7.加毕后,盖上平皿盖,将平皿翻过来,置湿盘中,37℃自由扩散24h~48h。

(三)结果判定

1.用以检测抗原或比较抗原差异时,将抗血清置中心孔,将待测抗原或需比较的抗原置于周围相邻孔。若出现沉淀带*融合,证明为同种抗原;若二者有部分相连,表明二者有共同抗原决定簇;若二条沉淀线相互交叉,说明二者抗原*不同。

2.用做血清流行病学调查时,将标准抗原置中心孔,周围1、3、5孔加标准阳性血清,2、4、6孔分别加待检血清。待检孔与阳性孔出现的沉淀带*融合者判为阳性。待检血清无沉淀带或所出现的沉淀带与阳性对照的沉淀带*交叉者判为阴性。待检孔虽未出现沉淀带,但两阳性孔的沉淀带在接近待检孔时,两端均内向有所弯曲者判弱阳性。若仅一端有所弯曲,另一端仍为直线者,判为可疑,需重检。重检时,可加大检样的量。

检样孔无沉淀带,但两侧阳性孔的沉淀带在接近检样孔时变得模糊、消失,可能为待检血清中抗体浓度过大,致使沉淀带溶解,可将样品稀释后重检。

3.用以检测的抗血清的效价时,将抗原置中心孔,抗血清倍比稀释后置周围孔,以出现沉淀带的血清zui高稀释倍数为该抗血清的琼扩效价。

(四)注意事项

1.不规则的沉淀线可能是加样过满溢出、孔型不规则、边缘开裂、孔底渗漏、孵育时没放水平、扩散时琼脂变干燥、温度过高蛋白质变性或未加防腐剂导致细菌污染等所致。

2.抗原抗体的比例与沉淀带的位置、清晰度有关。如抗原过多,沉淀带向抗体孔偏移和增厚,反之亦然。可用不同稀释度的反应液试验后调节。

 

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