ELISA试剂盒中抗血清制备方法步骤

　　一、目的：
　　
　　1、了解抗血清制备的基本过程：
　　
　　2、掌握抗血清的收集和保存方法。
　　
　　二、原理：
　　
　　ELISA试剂盒抗血清为含有某一类具有特异免疫功能的抗体分子的血清，一般为动物被人工注射某类抗原后制备的动物血清。价的抗血清用于研究工作以及疾病的诊断和治疗。
　　
　　一种抗原能否引起抗体生成反应，一方面取决于抗原分子表面有无抗原决定（Antigenicdeterminant），另一方面取决于机体的免疫状态，当具备以上两个条件后，抗体生成将遵循抗体生成的一般规律——初次反应和再次反应。
　　
　　抗原的种类繁多，包括天然的蛋白质抗原和细胞性抗原、合成性抗原以及基因工程抗原等，不同的抗原免疫动物具有不同的特殊性。一般*抗原免疫动物需加用佐剂，尤其在使用可溶性抗原时，以期得到价的抗血清;合成性抗原和基因工程抗原等半抗原物质需先通过人工的方法与蛋白质载体连接后再与佐剂混合免疫动物，方可获得理想的免疫效果。使用佐剂后可增加抗原的免疫原性和延长抗原在机体内存留的时间，从而改变了抗原原有的免疫原性。
　　
　　三、材料：
　　
　　1、金属编号牌（对动物作标记录）或染料;
　　
　　2、1毫升，5毫升、20毫升注射器;
　　
　　3、采血针头（9#，12#），卡价苗针头（41/2#—51/2#）;
　　
　　4、灭菌平皿，疫苗瓶，青霉素瓶，皮塞以及吸管，脱脂棉;
　　
　　5、卡介苗（75mg/ml）;
　　
　　6、抗原（小鼠血清）;
　　
　　7、青霉素溶液，链霉素溶液和5%葡萄糖溶液;
　　
　　8、液体石腊（医用），羊毛腊（配制佐剂用）;
　　
　　9、灭菌生理盐水，消毒用酒精，2.5%碘酒;
　　
　　10、1.5%琼脂，玻板，饭盒（保湿、保湿作用）;
　　
　　11、实验动物（家兔）。
　　
　　12、分离血清
　　
　　必须在无菌条件下进行，待收集于平皿或三角瓶内的血液凝固之后，用无菌滴管在无菌环境（例如超净工作台）中把血块与瓶壁剥离后，放入37℃，1～2h取出后放入4℃，使血清充分析出（不能冰冻，否则产生溶血），经离心沉淀分出血清，放进低温冰箱保存。使用前必须经过签定合格后再分装保存备用。
　　
　　13、ELISA试剂盒抗血清的保存
　　
　　1）经签定合格后的抗血清，以1:100比例加入1%的硫柳汞或5%的叠氮钠，使其zui后浓度分别为0.01%或0.05%。
　　
　　2）用无菌滴管将抗血清分装小管，每管装1ml左右。
　　
　　3）-20℃以下保存，可保存2年以上。
　　
　　4）如有条件可将血清冷冻干燥保存于4℃以下，保存时间更久
　　
　　四、注意事项
　　
　　1、动物的免疫反应存在着个体差异，甚至有人报告不同品种动物一次免疫后产生的抗体的差别可高达500倍，所以制备抗血清时不能只免疫一只动物，一般免疫3～4只，因为有的动物可能产生抗体效价很低或不产生抗体，免疫反应好的动物所能提供的抗体往往高于一般动物3～4倍。
　　
　　2、为制备单价特异性高的抗血清，所用抗原纯度越高越好，因此，在纯化抗原过程中应尽量除去可能存在的杂蛋白，这样可以省去许多时间来吸收抗血清中的非特异性抗体。
　　
　　3、要制备价的抗体，必须要加佐剂（一般采用*福氏佐剂），加佐剂后免疫动物，抗体效价至少可增加5倍。但也应考虑到，如果抗原中有微量的杂蛋白存在，即使0.005mg，亦可因有佐剂而产生非特异性的抗体，所以要根据实验需要和抗原的纯度适当地使用佐剂。
　　
　　4、制成的抗原乳剂是否为油包水乳剂应进行检查，否则会影响免疫效果，如不是油包水乳剂，应重新制备。
　　
　　5、当抗原量过少不易提纯时，可采用抗原抗体在琼脂扩散中形成的沉淀线直接免疫动物制备抗体。
　　
　　6、ELISA试剂盒抗血清效价一般以抗血清稀释倍数表示。血清效价的检测方法很多，灵敏度各不同，因此在表示抗血清效价时，应标明检测方法。另外，在沉淀反应中，出现沉淀时的抗原、抗体比例有一较大的范围，如用不同浓度的抗原测定效价时，结果会因此有别，所以在测定抗血清效价时，需注意抗原的浓度。
　　
　　7、分装保存的抗血清应注明抗血清的名称，效价，制备日期以及包装量。