人胃癌顺铂耐药株

1.试剂和溶液

1）转印缓冲液：0.025M Tris base , 0.187 M甘氨酸 , 25%甲醇

2）氨基黑溶液：0.1% 酸性黑10B

3）1×TBST：25mM Tris-HCl ( pH 8.0 ) , 0.2 M NaCl ,0.1%Tween 20

4）封闭液：TBST配制的5%牛奶

5）抗体稀释液：TBST配制的5%牛奶

6）显色系统：ECL显色

2.实验步骤

1电泳：将裂解液进行SDS-PAGE电泳，80v，30分钟，120v，90分钟；

2转膜：PVDF膜在甲醇中浸泡约30秒左右，滤纸浸泡在转印缓冲液预湿，半干法转印到PVDF膜上，10v，150分钟；

3染色：氨基黑染色5分钟，甲醇褪去背景色，观察条带；

4膜活化：将PVDF膜置于甲醇活化1min，用纯水洗膜2次后再用TBST洗涤3次；

5封闭：将膜条置于5%牛奶或2% BSA中，室温混摇2h；

6一抗孵育：将待检抗体用3%牛奶或2% BSA稀释到合适浓度（参照抗体说明书，根据客户预实验结果，稀释度上下浮动一个数量级都为正常），将膜放入对应的已稀释待检样品中，置4℃混摇孵育隔夜；

7洗涤：取出膜放在TBST中洗涤3×5min；

8二抗孵育：将膜取出放入稀释好的HRP标记的二抗（参照二抗说明书进行稀释）中，室温混摇2h；

9洗涤：取出膜放在TBST中洗涤3×5min；

10ECL显色：将膜取出放入混匀的ECL显色液中，孵育3min，将膜取出贴在有荧光角标的胶片上，迅速用保鲜膜包好；

11曝光：把底片放在暗盒中，根据荧光强度分别对X光胶片作不同时间段的曝光，曝光结束后，将底片取出，1min显影，30s清洗，1min定影，30s清洗，晾干；

12结果分析：用扫描仪将曝光后的X光胶片扫描，做后续结果分析。

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