1 范围
本标准规定了蜂蜡中二十八烷醇、三十烷醇含量的测定方法。
本标准适用于蜂蜡中二十八烷醇、三十烷醇含量的测定。
本标准检出限：二十八烷醇的检出限为0.1% ，三十烷醇的检出限为0.16%。
2 规范性引用文件
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GB/T 6379.1 测定方法与结果的准确度（正确度与精密度）第1部分: 总则与定义
GB/T 6379.2 测定方法与结果的准确度（正确度与精密度）第2部分: 确定标准测定方法重复性与 再现性的基本方法 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
3 原理
试样经回流水解后，用氯仿提取样品中的二十八烷醇、三十烷醇，提取液经无水硫酸钠净化，滤膜 过滤后，气相色谱火焰离子化检测器检测，外标法定量。
4 试剂
除非另有说明，均使用分析纯试剂，水为GB/T6682规定的一级水。
4.1 氢氧化钾。
4.2 无水硫酸钠。
4.3 氯仿。
4.4 95%乙醇。
4.5 0.5 mol/L 的氢氧化钾乙醇溶液；称取 2.8 g 氢氧化钾，用 100mL 95%乙醇溶解于塑料瓶中，常温 密封保存。
4.6 二十八烷醇、三十烷醇标准品：纯度≥98%。
4.7 二十八烷醇、三十烷醇标准储备液：分别称取 50 mg 二十八烷醇、三十烷醇标准品，至 0.1 mg， 放入同一 100 mL 容量瓶中，加氯仿超声波溶解后定容。常温密封环境下，有效期三个月。
4.8 二十八烷醇、三十烷醇标准工作溶液：准确吸取标准储备液（4.7）0.2 mL，1.0 mL，2.0 mL， 5.0 mL，10.0 mL 于 10 mL 容量瓶，用氯仿配制成 10.0 mg/L，50.0 mg/L，100.0 mg/L，250.0 mg/L，500.0 mg/L 的标准工作溶液。常温密封环境下，有效期一个月。
5 仪器设备
5.1 气相色谱仪：配有火焰离子化检测器（FID）。
5.2 超低温冰箱（-86℃）。
5.3 高速粉碎研磨仪。
5.4 分析天平：感量 0.1 mg 和 0.001 g。
5.5 旋转蒸发仪。
5.6 回流装置。
5.7 超声波。
6 试样制备与保存
6.1 试样的制备 取样品 200 g 置于超低温冰箱中，1h 后取出，用粉碎机研磨成粉状，置于样品瓶中，密封标记。
6.2 试样的保存 将试样于-18 ℃保存。
7 测定步骤
7.1 提取
称取均匀的试样 0.25 g，至 0.001 g，置于 150 mL 三角瓶中，加入 20 mL 氢氧化钾溶液（4.5）， 水浴 90 ℃ 回流 2 h， 60 ℃旋转蒸发去除乙醇后，加入 50 mL 氯仿溶解残渣，并将溶液全部转移至透 明玻璃离心管中，加入 30 mL 水，漩涡振荡 1 min，静置，除去上层液体，再重复用 30 mL 水清洗两次 后，将有机相转移至 100 mL 容量瓶中，并用氯仿定容。测定前，取适量溶液经无水硫酸钠干燥，用 0.45 μm 微孔滤膜过滤，待气相色谱测定。超过线性范围的样品，需要稀释后重新测定。
7.2 绘制标准曲线
吸取标准工作液于进样瓶中，气相色谱仪测定标准溶液的响应值（峰面积），以浓度为横坐标、峰面 积为纵坐标，绘制标准曲线。
7.3 气相色谱条件
色谱柱：（5%-苯基)-甲基聚硅氧烷 30 m × 0.25 mm（内径）×0.25 μm 或相当者； 柱温：200 ℃保持 1 min，以 5 ℃/min 的速率升温到 320 ℃，保持 10 min； 进样口温度：320 ℃； 检测器温度：340 ℃； 载气：氮气（N2），纯度≥99.99%； 燃气：氢气（H2），纯度≥99.99%； 柱流速：1.0 mL/min； 氢气流速：30 mL/min； 空气流速：300 mL/min； 不分流进样：2 μL。
7.4 气相色谱测定
取适量试样溶液和相应的标准工作溶液，作单点或多点校准，以试样峰与标准溶液峰相对保留时间 定性，以色谱峰面积值定量。标准工作液及试样液中的响应值均应在仪器检测的线性范围之内。标准溶 液和试样溶液的气相色谱图见附录 A。
8 结果计算
试样中二十八烷醇、三十烷醇的含量按式（1）计算：
式中：
x―试样中二十八烷醇、三十烷醇质量百分比含量，%；
c―从标准曲线中得到的被测组分的浓度，单位为毫克每升（mg/L）；
v―试样溶液定容体积，单位为升（L）；
m―试样的质量，单位为克（g）。
测定结果取其两次测定的算术平均值，计算结果保留三位有效数字。
9 精密度
9.1 重复性
在重复性条件下，获得的两次独立测试结果差值不得超过重复性 r。r= 2.8× Sr（重复性标准差）。
9.2 再现性
在再现性条件下，获得的两次独立测定结果，差值不得超过再现性 R。R= 2.8×SR（再现性标 准差）。
二十八烷醇 重复性限 r 0.40 再现性 R 0.42
三十烷醇 重复性限 r 0.52 再现性 R 0.53
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