艾纳香（Blumea balsamifera L），别名管芽，假东风草[1]、大风艾、大艾、冰片艾等，属于菊科艾纳香属多年生木质草本植物，在我国主要产于广西、贵州、云南、广东等省[2]，以其全草或地上部分入药，具有镇痛、发汗、祛风除湿、去痰止咳、通经止血等功效，是一种重要的民间药物。作为天然中草药，艾纳香含有多种有效成分，已经鉴定的有黄酮类、有机酸、萜类等[3-5]。同时，艾纳香是天然龙脑的重要来源，艾纳香精油中含30%左右龙脑[6]，是名贵药材、香料、化妆品的原料及食品保健品的添加剂。
艾纳香属多年生宿根植物，主要以宿根分株繁殖，分生苗移栽成活率低;艾纳香利用种子育苗发现种子结实率低、休眠期长、发芽率低[7，8]。这些情况导致艾纳香种苗短缺，严重制约了艾纳香的规模化生产，因此必须研究艾纳香的组织培养以快速获得批量种苗，扩大种植规模以满足日益增长的市场需求。此外，在进行组织培养时，直接以组织培养物替代原药材是解决艾纳香资源短缺的重要方法。对不同培养条件下的艾纳香中龙脑含量进行比较，有利于扩宽艾纳香药材的应用，使这一古老的中药为人类健康发挥更大的作用。
1 材料与方法
1.1 仪器
7890A/5975C气质联用仪（Agilent公司）。
1.2 试剂
龙脑对照品，无水乙醇。
1.3 供试材料
艾纳香组培愈伤组织;艾纳香组培苗由贵州民族大学化学与环境科学学院组织培养实验室培养了7个月的组培苗;艾纳香野生苗采自贵州罗甸县。
1.4 龙脑对照品溶液的制备
称取龙脑对照品10 mg，置于10 mL的容量瓶中，加无水乙醇溶解并加至刻度，摇匀，即可得到浓度为1 mg/mL的溶液，作为标准品贮备液;另取200、300、400、500、600 μL的贮备液，分别置于10 mL容量瓶中加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液备用，浓度分别为0.02、0.03、0.04、0.05、0.06 mg/mL。
1.5 气质联用条件
1.5.1 色谱条件 采用HP-5MS气相色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）;进样口温度为280 ℃，采用程序升温，柱温起始温度为90 ℃，以5 ℃/min升温至100 ℃，维持3 min;再以5 ℃/min升温至150 ℃，维持2 min;分流比为40∶1;载气为高纯氦气，载流速度为1.0 mL/min;进样量为1.0 μL。1.5.2 质谱条件 电子轰击粒子源，电离能量为70 eV;离子源温度为230 ℃;传输线温度为210 ℃;四级杆温度为150 ℃。
1.6 样品的处理
分别将艾纳香愈伤组织、艾纳香组培苗、野生苗3种样品用研钵粉碎，称取粉碎样品8 g，放至250 mL的锥形瓶中，加无水乙醇100 mL，进行声提取（声时间为120 min，频率为59 Hz，功率为80%），冷却、摇匀、过滤，滤液置于100 mL容量瓶中，放冷，加无水乙醇至刻度，摇匀，从100 mL容量瓶中再取1 mL溶液，置10 mL容量瓶中，加无水乙醇至刻度，摇匀，即为样品溶液。
1.7 龙脑对照品的气质联用分析
分别从0.03 mg/mL的龙脑对照品溶液及样品溶液中精密量取1 μL溶液，运用气质联用仪进行测定。
1.7.1 标准曲线的绘制 分别精密吸取浓度为0.02、0.03、0.04、0.05、0.06 mg/mL的龙脑对照品溶液各1 μL，依次进样，运用气质联用仪分别测定其峰面积，以龙脑对照品的峰面积为纵坐标，龙脑对照品浓度为横坐标，绘制标准曲线。
1.7.2 精密度测定 取浓度为0.03 mg/mL的龙脑对照品溶液1 μL，连续进样6次，根据峰面积计算其相对标准偏差。
1.7.3 重复性试验 取艾纳香野生苗，按照样品溶液制备方法配制6份100 mL的溶液，根据气质联用法依次对6份供试品溶液进行测定，记录样品的峰面积，计算其相对标准偏差。
1.7.4 加标回收率试验 分别称取艾纳香组培苗和贵州罗甸野生苗各0.04 g，制备成样品溶液，从中各取出6份，先测出药材中龙脑的含量，再向每份中加入0.300 mg龙脑对照品，由气质联用仪测定6个样品峰面积，计算平均回收率以及相对标准偏差。
1.7.5 样品含量的测定 分别量取愈伤组织供试品溶液、组培苗供试品溶液和野生苗供试品溶液各1 μL依次进样，测定出峰面积，计算供试品溶液中龙脑的含量，每份平行测定3次。
2 结果与分析
2.1 龙脑对照品溶液及样品溶液气质联用分析
从0.03 mg/mL的对照品溶液及样品溶液中精密量取1 μL溶液进样，从图1至4可以看出，龙脑标准品的出峰时间在7.621 min;样品色谱图在7.621 min有一吸收峰与龙脑标准品保留时间一致;质谱图检索结果为龙脑成分。
2.2 线性关系分析
以龙脑的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，见表1、图5，计算回归方程为：y=173.602 5 x，R2为0.997 01。结果表明，龙脑在0.02～0.06 mg/mL内线性关系良好（n=5）。
2.3 精密度测定结果
由精密度试验方法，用气质联用仪进行分析，结果见表2，其相对标准偏差（RSD）为0.44%。表明方法的精密度良好。
2.4 重复性试验结果
根据重复性试验考察方法，由气质联用仪进行测定，结果见表3。
由表3可得，6份供试品溶液中龙脑平均含量为3.621 6 mg/g，RSD为0.16%，表明方法的重复性好。
2.5 加标回收率试验结果
测得组培苗中龙脑的平均回收率97.11%，RSD为1.14%;野生苗中龙脑的平均回收率97.78%，RSD为0.67%，表明该方法的度高（表4）。
2.6 样品含量的测定
从表5可以得出艾纳香组培苗中龙脑的平均含量为3.216 7 mg/g，贵州罗甸艾纳香野生苗中龙脑的平均含量为3.620 0 mg/g。
3 小结与讨论
在拟定的色谱条件下，以无水乙醇作为艾纳香中龙脑的提取溶剂，采用声提取，简化了样品的制备方法，而且艾纳香中龙脑的含量测定没有受到其他成分的干扰。气质联用仪用于检测挥发性物质灵敏度高、度好。运用该方法，在对照品标准溶液中，色谱图中龙脑出峰的时间在7.621 min，愈伤组织的色谱分析显示，在该时间处没有吸收峰，这说明愈伤组织中不存在龙脑。组培苗、罗甸野生苗质谱图分析确定是龙脑，其中组培苗中龙脑的含量较野生苗低，但差异不大，原因可能是组培苗培养时间较短，龙脑在植物体内有一个逐步累积的过程。但组培苗可以人工快速培育繁殖，缩短培育周期，为艾纳香药材应用提供的苗木，以满足日益增长的市场需求。
