1. 原理

免疫荧光技术是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检查细胞内的相应抗原（或抗体）。在细胞中形成的抗原抗体复合物上含有标记的荧光素，荧光素受激发光的照射，由低能态进入高能态，而高能态的电子是不稳定的，以辐射光量子的形式释放能量后，再回到原来的低能态，这时发出明亮的荧光，利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞，从而确定抗原或抗体的性质和定位，以及利用定量技术测定含量。免疫荧光技术分直接法、间接法和补体法，zui常见的为间接法。

2. 常见荧光素特性

（1）异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）

 黄色结晶粉末，吸收光：490－495 nm，发射光：520－530 nm，明亮的黄绿色荧光。

（2）藻红蛋白（phycoerythrin，PE）

 吸收光：490－560 nm，发射光：595 nm，红色荧光。

3. 实验步骤

（1）在培养板中将已爬好细胞的玻片用PBS浸洗3次，每次3 min；

（2）用4%的多聚甲醛固定爬片15 min， PBS浸洗玻片3次，每次3 min；

（3）用0.5%Triton X-100（PBS配制）室温通透20 min（细胞膜上表达的抗原省略此步骤）；

（4）PBS浸洗玻片3次，每次3 min；

（5）在玻片上滴加正常山羊血清，室温封闭30 min；

（6）吸水纸吸掉封闭液，不洗，每张玻片滴加足够量的稀释好的一抗并放入湿盒，4℃孵育过夜；

（7）PBST 浸洗爬片3次，每次3 min，吸水纸吸干爬片上多余液体后滴加稀释好的荧光二抗，湿盒中20－37℃孵育1 h；

（8）PBST浸洗切爬片3次，每次3 min；

（9）滴加DAPI避光孵育5 min，对标本进行复染核，PBST、5 min×4次洗去多余的DAPI；

（10）用吸水纸吸干爬片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片；

（11）在荧光显微镜下观察。

4. 注意事项
（1）荧光染色后一般在1 h内完成观察，或于4℃保存4 h，时间过长，会使荧光减弱；
（2）每次试验时，需设置以下三种对照：
        阳性对照：阳性血清+荧光标记物
        阴性对照：阴性血清+荧光标记物
        荧光标记物对照：PBS+荧光标记物
（3）标本片需在操作的各个步骤中，始终保持湿润，避免干燥；
（4）一抗和二抗应始终保持在标本片上，避免因放置不平使液体流失，从而造成非特异性荧光染色。

注意事项： 1.新鲜组织固定于4%多聚甲醛24h以上； 2.取材切面要平整，厚度不宜超过2mm； 3.请明确拍照部位及拍照倍数(一般为40X、100X、200X、400X)。