western blot 实验经验总结（一）

western blot 实验经验总结（一） 问题：zui近做 western blot 实验，目的蛋白大小是 25 kD。实验结果显示，目的条带处无任何信号，而内参条带清晰。同样条件下，内参照效果很好，为何目的条带却检测不到？且据文献报道，同种样品中该蛋白是高丰度的。

 WB 检测中蛋白质条带无信号的可能性有：目的蛋白在样品中没有表达；目的蛋白在样品处理过程中发生降解；一抗或二抗质量差；抗体浓度不合适；转膜效果不好，胶上蛋白没有转到膜上或者转过了。首先，用考马斯亮蓝染色转过膜的 SDS-PAGE 胶，结果未看见明显条带，说明转膜后胶上基本没有蛋白。其次，抗体购自高信誉的试剂公司，暂时不考虑是抗体质量问题导致成实验失败。另外文献已报道该样品中目标蛋白表达较高，排除不表达的可能性。且处理样品的过程非常短，保存得当，未检测到降解条带，因此排除样品降解。

zui后，膜和转膜条件。内参条带清晰，目标条带分子量较小，排除没有转到膜上。因此zui大可能是蛋白转过了，用小孔径膜，缩短转膜时间。