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BC5340-50T/24S L -乳酸（L -LA）含量检测试剂盒 糖酵解
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- BC5340-50T/24S
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北京索莱宝科技有限公司
（Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. ）是一家从事生物学试剂及试剂盒的高科技生物企业。
总部位于北京，并在设有经销或代理机构。产品因可靠而稳定的质量和较为完善的售后服务确立了“Solarbio”良好的品牌形象。公司秉承“以客户为中心、以产品为保障、以诚信为基础、以创新为宗旨”的发展理念，拥有专业的研发和质量检测团队以及的仓储和物流系统。“Solarbio”已经得到科研工作者的认可，成为广大经销商推崇的。
公司拥有一批专业的研发人员，我们专注于生物产品的不断完善和创新。产品覆盖面广，品质可靠。先后开发了涵盖分子生物学、细胞生物学、免疫学、生物医学等领域的多种试剂及试剂盒。同时，索莱宝公司提供各种常规生化试剂，库存常备产品多达10000多种，可随时为广大科研工作者提供各类专业试剂。在质量方面，索莱宝谨记公司信念：质量高于一切。所有研发的产品都设有严谨的生产流程，科学的质量检测方法和成熟的质量检测程序，我们恪守对每一位用户的承诺：用专业的态度做专业的品牌。同时，公司组建了一支专业的技术服务队伍，能够为科研工作者提供专业的技术服务。每一位购买索莱宝产品的用户都能够得到专业的咨询和完善的售后服务。
索莱宝公司坚持与接轨，注重和企业的合作与交流，并提供产品代理、市场咨询等多项服务。公司将一如既往与世界更多合作，不断为广大生物科研工作者提供更优质的产品和服务。公司理念：“为科研服务，为生命尽责”。一个人能够走多远，取决于与谁同行。索莱宝公司期待与各同行精诚合作。
索莱宝诚招生物试剂研发人员，期待与广大同行精诚合作，为广大科研工作者提供优质的产品，高效的物流以及专业的售后服务。索莱宝感谢所有朋友的支持与帮助，您的支持是我们前进的动力和保障。让我们携手同行，共同创造美好的明天。
详细信息
L-乳酸（L-LA）含量检测试剂盒（WST显色法）说明书
可见分光光度法
注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。
货号：BC5340
规格：50T/24S
产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。
试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
提取液一 | 液体30 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
提取液二 | 液体5 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
试剂一 | 液体20 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
试剂二 | 液体60 μL×1支 | 2-8℃保存 |
试剂三 | 粉剂×1瓶 | -20℃保存 |
试剂四 | 液体12 mL×1瓶 | |
标准品 | 粉剂×1支 | 2-8℃保存 |
溶液的配制：
1、 试剂二：临用前按试剂二（V）：蒸馏水（V）=10μL：450μL（9T）的比例配制试剂二溶液，现用现配；
2、 试剂三：临用前加入8 mL 蒸馏水混匀，可分装后-20℃保存4周，避免反复冻融；
3、 标准品：临用前加入1.04 mL蒸馏水配成100 μmol/mL 的标准溶液，2-8℃可保存12周；
产品说明：
乳酸是生物体代谢过程中重要的中间产物，与糖代谢、脂类代谢、蛋白质代谢及细胞内能量代谢密切相关，乳酸含量是评估糖元代谢的和有氧代谢的重要指标。乳酸在乳酸脱氢酶的作用下生成丙酮酸，同时使NAD+还原生成NADH和H+，在1-mPMS作用下，WST-1可与NADH反应，产生水溶性formazan，其在450nm处有最大吸收峰，据此可计算乳酸含量。
注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
分析天平、研钵/匀浆器/超声波细胞破碎仪、离心机、可见分光光度计、1mL玻璃比色皿、水浴锅/恒温培养箱、蒸馏水。
操作步骤：
一、 样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
1. 组织：按照质量（g）：提取液一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g，加入1mL提取液一）加入提取液一，冰浴匀浆后于4℃，12000g离心10min，取0.8mL上清液，再缓慢加入0.15mL提取液二，缓慢吹打混匀至无气泡产生，4℃ 12000g离心10min后取上清待测。
2. 细胞/细菌：按照细胞/细菌数量（104个）：提取液一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞/细菌加入1mL提取液一），冰浴超声波破碎细胞/细菌（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；于4℃，12000g离心10min，取0.8mL上清液，再缓慢加入0.15mL提取液二，缓慢吹打混匀至无气泡产生，4℃ 12000g离心10min后取上清待测。
3. 血清（浆）等液体：取100μL液体加入1mL提取液一，4℃ 12000g离心10min，取0.8mL上清液，再缓慢加入0.15mL提取液二，缓慢吹打混匀至无气泡产生，4℃ 12000g离心10min后取上清待测。
注：提取液二需缓慢加入，加入后会产生大量气泡，建议使用2mL EP管进行操作。
二、测定步骤
1、 分光光度计预热30min以上，波长调至450nm，蒸馏水调零。
2、 标准液的稀释：将100μmol/mL的标准溶液用蒸馏水稀释为0.625、0.3125、0.15625、0.078、0.039、0.020、0.01μmol/mL的标准溶液备用。
3、标准品稀释表：
序号 | 稀释前浓度（μmol/mL） | 标准液体积（µL） | 蒸馏水体积（µL） | 稀释后浓度（μmol/mL） |
1 | 100 | 50 | 950 | 5 |
2 | 5 | 100 | 700 | 0.625 |
3 | 0.625 | 200 | 200 | 0.3125 |
4 | 0.3125 | 200 | 200 | 0.15625 |
5 | 0.15625 | 200 | 200 | 0.078 |
6 | 0.078 | 200 | 200 | 0.039 |
7 | 0.039 | 200 | 200 | 0.020 |
8 | 0.020 | 200 | 200 | 0.010 |
实验中每个标准管需50µL标准溶液
3、加样表：（按顺序将下列试剂加在EP管中）
测定管 | 对照管 | 标准管 | 空白管 | |
样本（μL） | 50 | 50 | - | - |
标准品（μL） | - | - | 50 | - |
蒸馏水（μL） | - | 50 | - | 50 |
试剂一（μL） | 200 | 200 | 200 | 200 |
试剂二（μL） | 50 | - | 50 | 50 |
试剂三（μL） | 100 | 100 | 100 | 100 |
试剂四（μL） | 150 | 150 | 150 | 150 |
充分混匀，于37℃水浴锅/恒温培养箱避光准确反应30min。 | ||||
蒸馏水（μL） | 450 | 450 | 450 | 450 |
混匀后，取出全部反应液到1mL比色皿中，于450nm处测定吸光值，分别记为A测定管，A对照管，A标准管，A空白管，计算ΔA测定=A测定管-A对照管；ΔA标准=A标准管-A空白管。每个测定管需设置一个对照管，空白管和标准曲线只需测定1-2次。 | ||||
三、乳酸含量的计算
1、标准曲线的绘制
以各标准溶液浓度为x轴，以其对应的吸光值（ΔA标准）为y轴，绘制标准曲线，得到标准方程y=kx+b，将
ΔA测定带入公式中得到x（μmol/mL）。
2、乳酸含量计算
（1）按照蛋白含量计算
L-LA含量（μmol/mg prot）=x×V样本÷（V样本×Cpr）=x÷Cpr
（2）按照样本质量计算
L-LA含量（μmol/g 质量）=x×（V上清+V提取液二）÷（W×V上清÷V提取液一）=1.1875×x÷W
（3）按照细胞/细菌数量计算
L-LA含量（μmol/104 cell）=x×（V上清+V提取液二）÷（N×V上清÷V提取液一）=1.1875×x÷N
（4）按照液体体积计算
L-LA含量（μmol/mL）=x×（V上清+V提取液二）÷ [V液体×V上清÷（V提取液一+V液体）]=13.0625×x
V样本：加入的样本体积，0.05mL；W：样本质量，g；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL，蛋白浓度需自行测定；V上清：提取时上清液体积，0.8mL；V提取液二：加入的提取液二体积，0.15mL；V提取液一：加入的提取液一体积，1mL；N：细胞/细菌数量，104个；V液体：液体样本体积，0.1mL。
注意事项：
1. ΔA测定的测定范围在0.01-1之间。如果测定吸光值超过线性范围吸光值，可以用蒸馏水稀释样本后再次测定，如果测定吸光值小于线性范围吸光值，需要增加样本量后再次测定，注意同步计算公式。
2. 提取液一中含有蛋白质沉淀剂，因此上清液不能用于蛋白浓度测定。如需测定蛋白含量，需另取样本。
实验实例：
1、 取0.1466g小鼠肝加入1mL提取液一，冰浴匀浆后离心，取0.8mL上清后加0.15mL提取液二，离心取上清后用蒸馏水稀释两倍，按照测定步骤操作，使用1mL比色皿测得计算ΔA测定=A测定管-A对照管=0.972-0.092= 0.880，根据标准曲线y=1.365x-0.0041，R2=0.9999，计算x=0.6477，按样本质量计算含量得：
L-LA含量（μmol/g 质量）= 1.1875×x÷W×稀释倍数（2）=10.493 μmol/g质量。
2、 取0.1063g红薯根加入1mL提取液一，冰浴匀浆后离心，取0.8mL上清后加0.15mL提取液二，离心取上清，之后按照测定步骤操作，使用1mL比色皿测得计算ΔΔA测定=A测定管-A对照管=0.124-0.099=0.025，根据标准曲线y=1.365x-0.0041，R2=0.9999，计算x=0.0213，按样本质量计算含量得：
L-LA含量（μmol/g 质量）=1.1875×x÷W=0.2382μmol/g质量。
3、 取100μL羊血清加入1mL提取液一，离心，取0.8mL上清后加0.15mL提取液二，离心取上清，之后按照测定步骤操作，使用1mL比色皿测得计算ΔA测定=A测定管-A对照管=0.587-0.095=0.492，根据标准曲线y=1.365x-0.0041，R2=0.9999，计算x=0.3634，按照液体体积计算含量得：
L-LA含量（μmol/mL）=13.0625×x=4.748 μmol/mL。
参考文献：
Eolbergrová J, MacMillan V, Siesjö B K. The effect of moderate and marked hypercapnia upon the energy state and upon the cytoplasmic NADH/NAD+ ratio of the rat brain[J]. Journal of neurochemistry, 1972, 19(11): 2497-2505.
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