凋亡因子Caspase-389检测实验

Caspase3

Caspase是- -个在细胞凋亡过程中起重要作用的蛋白酶家族。Caspase3也称CPP32, 是细胞凋亡过程中的一个关键酶，可以剪切procaspase2.6. 7和9，并可以直接特异性剪切许多caspase底物，包括PARP (poly(ADP-ribose) polymerase), ICAD (Inhibitor of caspase-activated Deoxyri- bonuclease), gelsolin和fodrin等。 这些由caspase 3介导的蛋白剪切是细胞凋亡分子机制的重要组成部分。caspase 3在细胞核凋亡过程中也起到了关键作用，包括染色质固

缩，DNA片段化等。同时caspase 3对细胞起泡(Cell blebbing)也起到关键作用。

检测原理基于casepase 3可以催化底物AC-DEVD-pNA产生黄色的pNA(-itroaniline),从而可以通过测定吸光度来检测caspase 3的活性。pNA在405nm附近有强吸收。参照黄色产物pNA制作的标准曲线，可以作为定量caspase 3酶活性的标准品。

Caspase-8

Caspase 8通常以酶原的形式存在，在细胞凋亡的信号转导过程中被激活，Caspase 8被认为是细胞凋亡信号转导过程中上游的caspase,在Fas-receptor和TNFR-1介导的细胞凋亡 过程中caspase 8被激活,形成一个由p18和p10组成的二聚体，进一步激活下游的caspase 4, caspase 6。caspase 9和caspase 10。本方法基于Caspase 8可以催化底物AC-IETD-pNA产生黄色的pNA (-nitraniline),从而可以通过测定吸光度来检测Caspase 8的活性。pNA在405nm附近有强吸收。 检测样本的405nm OD值参照pNA制作的标准曲线，可以计算样品的Caspase 8酶活性。

Caspase-9

Caspase 9也称ICE-LAP6或Mch6,是细胞凋亡信号转导过程中上游的caspase。线粒体释放细胞色素c以后，caspase 9可以和细胞色素c以及Apaf1形成复合物，同时被激活。激活的caspase 9可以激活细胞凋的关键酶caspase 3,从而促进后续的细胞凋亡信号。Caspase 9的激活可以通过磷酸化进行调控。

本方法基于Caspase 9可以催化底物Ac- LEHD -pNA产“生黄色的pNA (p-nitroaniline),从而可以通过测定吸光度来检测

Caspase 9的活性。pNA在405nm附近有强吸收。检测样本的405nm OD值参照pNA制作的标准曲线，可以计算样品的Caspase 9酶活性。

Caspase1

Caspase2

Caspase4

Caspase6

凋亡因子Caspase 3/8/9检测样本准备:

1)细胞样品:取1x107个细胞(约1个T25的培养瓶细胞量) , 600g 4°C离心5分钟收集细胞，小心吸除上清，PBS洗涤一次。吸取上清后，每管细胞样品加入100u|裂解液重悬沉淀,冰浴裂解15分钟。4°C 16,000g离心10-15分钟， 把上清转移到冰浴预冷的离心管中。立即测定caspase 3的酶活性或-70°C保存样品。同时可以取少量样品用Bradford法测定蛋白浓度，尽量使蛋白浓度达到1-3mg/ml.

2)组织样品:约每10mg组织加入100ul裂解液，在冰浴上用玻璃匀浆器匀浆。然后把匀浆液转移到1 .5ml)离心管中，冰浴再裂解5分钟。4°C 16,000g离心10-15分钟，把上清转移到冰浴预冷的离心管中。立即测定caspase 3的酶活性或-70°C保存

样品。同时可以取少量样品用Bradford法测定蛋白浓度，尽量使蛋白浓度达到1-3mg/ml.

Caspase-3活性检测标准曲线

实验周期: 7-10个工作日内完成，重复检测优惠。

客户注意事项

1.抗体:事先咨询上海研谨生物，明确抗体种属以及是否有该抗体可使用。如无可由双方协商而定，客户自己购买提供或我公司代购;

2.标本收集与保存:

①组织样品:新鲜组织放入液氮或70度保存,组织不少于100mg (约绿豆大小) ;

②培养细胞:通过细胞计数取不少于000000个细胞于EP管，加入0.5ml生理盐水或蛋白保护剂，混匀后保存于冰箱(-70°C，避免反复冻融) ;

③血液细胞标本:以抗凝管保存血样或以淋巴细胞分离液分离细胞后加入0.5ml生理盐水或蛋白保护剂，保存(-70°C可长期保存，避免反复冻融)

④血清或细胞培养液标本:离心去掉杂质后取上清入EP管，保存(以上4°C可保存15-20天，-70°C可长期保存，避免反复冻融)

3、样本运输:可选以下任何的一种方式寄送标本

①组织样本、细胞样本以干冰运输或加入蛋白保护剂后加冰袋运输;

②细胞样本也可以直接快件寄送培养瓶(密封保证不污染，培养液不漏出,细胞不要长得太满，50%左右,灌满培养液) ;

③血清或上清液直接加冰袋寄送(密封保证液体不漏出，视路途远近2-3天可到达)。

实验代做服务：