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NF-KB p65活性检测实验
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详细信息
NF-KB p65活性检测实验
核转录因子NF-kappaB (NF-kB) 是一种重要的转录因子，参与调控多种与炎症、抗凋亡、
肿瘤形成和转化有关的基因表达。NF- kappaB (NF _kB)初被鉴定为在B细胞中和免疫球蛋白k轻链的增强子结合。但随后在非B-细胞的细胞质中被发现，形成NF-KB和kB的复合物。初在DNA结合蛋白复台物中分离的NF -kB是由p65(ReIA)和p50构成的异源双聚体。其他分离的单体包括p49 (也可称为p52) , p75 (C-Rel) ,p68(ReIB)。 p65,p68，p75单体起反式激活作用。p50, p49 (p52) 单体具有DNA结合活力，但只具有微量的反式激活作用。据报道p49和NF-kB的单体p65形成具有转录活力的异源双体，类似于p50/ p65异源双体。p49/ p65和p50/ p65异源双体在细胞质中受一种叫kBa/MAD-3的抑制剂调节。
IkB和p65单体结合，阻制了细胞核中的定位和DNA的结合。在体外高浓度的p65能形成同源双聚体，能和DNA微弱地结合。Poly(dl:dC)能抑制这一 反应 。p49和p50也能形 成同源双聚体，但在细胞中的浓度很低。通常,在作NF-KB的凝胶迁移实验时,在20ul的反应体积中，有溶于10 mM HEPES的0.28pmoles的NF -kB9寡核苷酸(pH7.9), 50mMKCI, 0.2mMEDTA, 2.5mM DTT, 10%甘油，0.05%NP-40。当用纯化的蛋白时，250-300ng足以形成凝胶迁移复合物， 而需用10ug的Hel a细胞核抽提物。凝胶迁移复合物在室温中保温30分钟，在50mMTris(pH8 3)和38mM甘氨酸的7%聚丙烯酰胺凝胶电泳中分离凝胶迁移复合物。含考马斯兰和二甲苯蓝色素的加样溶液只能加入到阴性对照反应中，因这两种色素会加剧NF-kB复合物的解离。当用Hel a细胞核抽提物作为结合蛋白来源时，可形成两种序列特异的凝胶迁移复合物，即p50/p50同源双聚体和p50/ p65异源双聚体。在表达p49，p50, p65的细胞中， 可检测到4个序例特异的凝胶迁移复合物(p49/ p49，p50/ p50，p50/ p65，p49/ p65)，如果存在高浓度的p65，可检测到微量的p65/p65.
下列试剂可加强NF- kB在体外的结合: mM的GTP, ATP, 精胺，亚精胺,钡或钙离子，ng的
Co+3(NH3)6 (12) 。提取组织或细胞核蛋白，利用不同形式的NF -Kb p65抗体捕获细胞核蛋白并加以区分,通过酶标仪450nm处测定核蛋白标准品与NF -Kb p65吸光度值，进行定量比较,从而明确目的蛋白的活化度。
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