多克隆抗体制备服务

多抗一般制备流程:*抗原的准备- +兔子的免疫-→ 效价检测和终放- +抗体亲和纯化- +抗体的浓缩和保存。

具体实验步骤如下:

1.兔子的准备

挑选健康的6周大小的新西兰大白兔两只(约2Kg) ，使其适应新的生活环境，至少稳定几天再进行*取血、预采血(作阴性参照用)

1.1将兔子小心的放入固定的架中，使兔子平静;

1.2小心剃去兔耳上的毛以使血管清晰可见(也可不剃);

1.3如果有必要，可用小棉球沾酒精涂抹血管部位使血管膨胀;

1.4用注射器从耳静脉抽取约10ml血液(约5ml血清);

1.5小心抽出针头，适当按压伤口以免流血，然后用酒精棉球消毒伤口;

1.6将收集的血液置于37 C灭活30min,后置于4" C过夜使其凝结释放血清;

1.7将凝结好的血液在10000r / min离心10min; h.收集 上清，即为血清。

兔子的免疫

2.1注射两只兔子的抗原为1ml,抗原缓冲溶液必须不含对兔子有害的化学试剂每只兔子初次免疫400ug抗原比较适合，也可适当减少以获得更好的结果，后续免疫每次为100ug即可。

2.2将1m的佛氏*佐剂与准备好的1m抗原充分混匀，呈乳白色; .

2.3小心从笼中取出兔子,织兔子免疫4个部位(背部和大腿根部均可)，每个部位250ul,针头呈45度角插入皮下1-2cm,注射完后停留数秒以防止抗原外流。

2.4兔疫周期为20天，免疫完后7-10天取血(包括中途测试取血和终放血)，总共免疫4-5次。

3.效价检测

3.1 2个参照阴性参照为预取血血清，均以1抗起始浓度稀释(封闭稀释液);阳性参照为以前

阳性血清

3.2于96孔板中每孔滴加100ul, 1ug/m抗原，于49C过夜， 也可以37°C孵育2小时。

3.3倒掉抗原溶液，每孔加入200u的封闭液， 49C过夜或者379C孵育2小时。

3.4倒去封闭液，在吸水纸上拍打尽量吸干残留液体，用洗涤液洗板三次每次尽量拍干残留液体，若要放置一段时间, 37°C烘干并用封口袋封好于20°C存放。

3.5取包被好的96孔板，第---孔加入阴性 参照液100ul,第二孔加入阳性参照液100ul,第三孔加入1:500的待测抗血清，后续各孔在此基础上倍比稀释,于37°C孵育1 小时。

3.6倒掉液体，用洗涤液洗板三次,拍干。每孔加入100u的HRP标记的小鼠抗兔lgG (1: 2000稀释)，于37°C孵育45分钟。

3.7倒掉液体，用洗涤液洗板三次，拍干。每孔加入100u的TMB底物(Sigma 单组份TMB ) 37°C孵育5-20分 钟(根据颜色深浅来决定显色的时间)。

3.8每孔加入50u的终止液(2N H2SO4)， 在酶标仪上读取波长450nm处的吸光值。

抗体效价检测达到100万以上后可以对兔子进行终放血。

抗体的纯化

4.抗体的亲和--亲和柱的制备

4.1 称取1mg CNBr- Sepherose 4B的琼脂糖凝胶加入2mmol/ L的盐酸中，4" C过夜使其充分溶涨，可获得3m溶涨胶。

4.2将凝胶转移入纯化柱中，用约20ml 2mmol / L的盐酸洗介质3次。

4.3用偶联缓冲液洗介质- -次，因为活化基团在偶联缓冲液PH值下易水解，所以此步骤在几分钟内完成。

4.4将溶解在5ml偶联缓冲液中的5-10mg的抗原加入凝胶中

4.5室温下轻轻混合摇动2-4小时，或4" C过夜,如需测定结合效率此步骤结束后取少量溶液待测。用20ml的偶联缓冲液洗介质一-次。

4.6加入15m1 1% BSA溶液室温下孵育2小时或4" C过夜。

4.7用磷酸盐缓冲液洗涤介质3次以上,每次15m以上h.

4.8抗原固相化完成，可用于纯化。

4.9若不立即使用或者使用后，用20%的乙醇封存。

5.抗血清的纯化和保存

5.1抗血清用PBS等体积稀释，5000-10000 / min离心15分钟，取上清.

5.2用10倍体积的PBS清洗抗原亲和柱以平衡柱子。

5.3将稀释好的抗血清10m加入平衡好的柱子中。

5.4室温下轻轻混合摇动2-4小时，或4" C过夜

5.5用10倍体积的PBS清洗抗原柱，以洗去结合在柱子上的杂蛋白

5.6用2倍体积的抗体洗脱液洗涤柱子，以得到特异性抗体

5.7用10倍体积PBS平衡柱子

5.8用20%的酒精封存柱子，4'C保存。

在得到洗脱的抗体后，经蔗糖或聚乙二醇浓缩后于PBS中透析除盐，使用紫外可见分光光度计在波长280nm处测定抗体OD值，所得OD值除以1.35即为所测抗体的浓度，添加40-50%甘油置于20^C可长期保存。

部分实验代做服务