Annexin V-Alexa Fluor 647/PI 凋亡检测试剂盒说明书
Annexin V-Alexa Fluor 647/PI Apoptosis Detection Kit
货号：K2577
保存：2-8 ℃避光保存
组分说明
Cat.No. K2577
KitSize 50
4×BindingBuffer 10ml
PropidiumIodide,PI 500 μl
AnnexinV-AlexaFluor647 250 μl
产品简介
AnnexinV-AlexaFluor647/PI凋亡检测试剂盒是一种采用AnnexinV-AlexaFluor647与 PI 双染法进行细胞早期凋亡分析的检测试剂盒。
细胞凋亡早期改变发生在细胞膜表面，这些细胞膜表面的改变之一是磷脂酰丝氨酸（PS）从细胞膜内转移到细胞膜外，使PS 暴露在细胞膜外表面。PS 是一种带负电荷的磷脂，正常主要存在于细胞膜的内面，在细胞发生凋亡时细胞膜上的这种磷脂分布的不对称性被破坏而使PS暴露在细胞膜外。Annexin V具有易于结合到磷脂类如 PS 的特性，对PS 有高度的亲和性。因此，该蛋白可充当一敏感的探针检测暴露在细胞膜表面的PS。PS 转移到细胞膜外不是凋亡所*的，也可发生在细胞坏死中。两种细胞死亡方式间的差别是在凋亡的初始阶段细胞膜是完好的，而细胞坏死在其早期阶段细胞膜的完整性就被破坏。另外一种活细胞非透过性荧光染料碘化丙啶（PropidiumIodide,PI）不能通过完整的活细胞，但能够对坏死和凋亡晚期的细胞进行染色，因此通常将 AnnexinV 与PI 配合染色，以区别凋亡早期细胞与坏死细胞和凋亡的晚期细胞。
注意事项
1. 消化细胞时不能用含EDTA 的胰酶。
2. 本试剂盒需使用流式细胞仪进行检测。
3. 需自备PBS 和去离子水。
4. 荧光染料均存在淬灭问题，保存和使用过程中请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。
5. PI 对人体有刺激性，请注意适当防护。
6. 请穿实验服并戴一次性手套操作。
操作步骤
1. 细胞样品的准备：
a. 对于贴壁细胞：小心收集细胞培养液到一离心管内备用。用胰酶消化细胞，至细胞可以被轻轻用移液管或枪头吹打下来时，加入前面收集的细胞培养液，吹打下所有的贴壁细胞，并轻轻吹散细胞。再次收集到离心管内。1000×g 左右离心3-5 分钟，沉淀细胞。对于特定的细胞，如果细胞沉淀不充分，可以适当延长离心时间或稍稍加大离心力。小心吸除上清，可以残留约50 μl 左右的培养液，以避免吸走细胞。加入约1 ml 4℃预冷的 PBS，重悬细胞，再次离心沉淀细胞，小心吸除上清。再次加入1ml4℃预冷的 PBS，重悬细胞，再次离心沉淀细胞。
b. 对于悬浮细胞：1000×g 左右离心3-5 分钟，沉淀细胞。对于特定的细胞，如果细胞沉淀不充分，可以适当延长离心时间或稍稍加大离心力。小心吸除上清，可以残留约 50 微升左右的培养液，以避免吸走细胞。加入约 1 ml 4℃预冷的PBS，重悬细胞，并转移到1.5 毫升离心管内。再次离心沉淀细胞，小心吸除上清，可以残留约 50μl 左右的 PBS，以避免吸走细胞。再次加入1ml4℃预冷的PBS，重悬细胞，再次离心沉淀细胞。
2. 用去离子水按1:4 稀释 BindingBuffer（4mlBindingBuffer+12ml 去离子水）；
3. 用 250μlBindingBuffer 重新悬浮细胞，调节其浓度为1×106/ml；
4. 取100μl 的细胞悬液于5ml 流式管中，加入5μlAnnexinV/AlexaFluor647 和 10μl20μg/ml 的 PI 溶液；
5. 混匀后于室温避光孵育15 分钟；
6. 在反应管中加400μlPBS，流式细胞仪（FACS）分析。
实验代做服务：
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