白介素-6 ELISA KIT
白介素-6 ELISA KIT 是一款用于定量检测生物样本中白介素 - 6 含量的工具,在免疫学、炎症研究等科研领域应用广泛。以下为你展开介绍:
检测原理:采用双抗体夹心 ELISA 技术。试剂盒中的酶联板已预包被抗 IL-6 特异性抗体。加入样本后,样本中的 IL-6 与固相抗体特异性结合,形成抗原 - 抗体复合物。随后加入酶标记的抗 IL-6 抗体,其与已结合在固相抗体上的 IL-6 进一步结合,形成 “固相抗体 - IL-6 - 酶标抗体” 的夹心结构。经过洗涤步骤,去除未结合的物质,再加入底物溶液(如 TMB)。在酶的催化下,底物发生显色反应,颜色的深浅与样本中 IL-6 的含量成正比。通过酶标仪在特定波长(通常为 450nm)下测量吸光度,与标准曲线对比,即可计算出样本中 IL-6 的浓度 。
试剂盒组成
酶联板:有 96 孔或 48 孔规格,预包被抗 IL-6 抗体,是反应的载体。
标准品:一般为冻干品,通常有 2 瓶。临用前需用标准品稀释液复溶,并稀释成不同浓度梯度,如 0、15.6、31.2、62.5、125、250、500、1000 pg/mL 等,用于绘制标准曲线 。
样本xi释液:用于稀释浓度过高的待测样本,确保样本浓度在试剂盒的检测范围内。
酶标抗体:即 HRP 标记的抗 IL-6 抗体,为浓缩液,需使用酶标抗体稀释液按要求进行稀释。
酶标抗体稀释液:专门用于稀释酶标抗体。
底物溶液:如 TMB 底物,与酶标抗体中的 HRP 发生反应产生颜色变化 。
洗涤液:多为浓缩液,使用时需按比例用蒸馏水或去离子水稀释,用于洗涤酶联板,去除未结合的物质,降低背景干扰 。
终止液:一般为强酸溶液(如硫酸),用于终止底物的显色反应,使反应液颜色稳定,便于读数 。
封板膜:在温育过程中覆盖酶联板,防止液体蒸发和外界污染 。
使用说明书:详细介绍试剂盒的使用方法、注意事项、性能指标等 。
样本要求
血清:采集血液后,室温放置 2 小时或 4℃过夜,1000×g 离心 20 分钟,取上清备用。采血应使用无热原、无内毒素的一次性器材 。
血浆:可用乙二胺四乙酸(EDTA)、肝素等抗凝剂。样本采集后 30 分钟内,在 2 - 8℃下 1000×g 离心 15 分钟,取上清 。
细胞培养上清:将细胞培养上清 1000×g 离心 20 分钟,去除细胞碎片和杂质后,取上清用于检测 。
组织匀浆:用预冷的磷酸盐缓冲液(PBS,0.01M,pH = 7.4)冲洗组织,去除残留血液。剪碎组织后,按 1:9(w/v)加入 PBS,在冰上充分研磨。再经 5000×g 离心 5 - 10 分钟,取上清用于检测 。
样本采集后若短期内检测,可保存于 4℃;若需长时间保存,需置于 - 20℃或 - 80℃冻存,且要避免反复冻融,溶血样本一般不适合检测 。
操作流程
准备工作:从冰箱取出试剂盒,提前 30 分钟平衡至室温。同时,将浓缩洗涤液按要求比例用蒸馏水或去离子水稀释备用 。
加样:设置空白孔、标准品孔和样本孔。空白孔加入样本xi释液,标准品孔加入不同浓度的标准品,样本孔加入处理好的样本,每孔加样量通常为 100μL,轻轻混匀,37℃温育 90 分钟 。
洗涤:温育结束后,弃去孔内液体,用洗涤液加满各孔,浸泡 1 - 2 分钟后甩干,重复洗涤 5 次,确保che底洗净未结合物质 。
加酶标抗体:每孔加入 100μL 稀释好的酶标抗体工作液,37℃温育 60 分钟 。
再次洗涤:重复上述洗涤步骤 。
显色:每孔加入 90μL 底物溶液,轻轻混匀,37℃避光显色 15 - 30 分钟(需根据实际显色情况判断) 。
终止反应:每孔加入 50μL 终止液,此时溶液颜色由蓝色变为黄色 。
读数:在加终止液后 15 分钟内,用酶标仪在 450nm 波长处测量各孔的吸光度(OD 值) 。
计算结果:以标准品浓度为横坐标,OD 值为纵坐标,绘制标准曲线。根据样本的 OD 值从标准曲线中查出对应的浓度,若样本进行了稀释,需乘以相应的稀释倍数,从而得到实际浓度 。
性能指标
检测范围:不同试剂盒有所差异,常见的检测范围为 15.6 - 1000 pg/mL 等区间,可满足多种样本中 IL-6 含量的检测需求 。
灵敏度:一般可低至 7.8 pg/mL 甚至更低,能够检测到样本中微量的 IL-6 。
特异性:对 IL-6 具有高度特异性,与其他细胞因子等物质几乎无交叉反应 。
重复性:板内变异系数一般小于 10%,板间变异系数小于 15%,保证了检测结果的稳定性和可靠性 。