服务简介

酵母是一种单细胞低等真核生物，培养条件普通，生长繁殖速度迅速，能够耐受较高的流体静压，用于表达基因工程产品时，酵母具有与其他真核生物类似的蛋白质分泌途径，外源基因的分泌表达，不仅方便了表达产物的分离纯化，同时也和表达产物的翻译后加工有关。酵母表达系统由于兼具原核以及真核表达系统的优点，因此利用此系统可高水平表达蛋白。常用的表达系统有酿酒酵母表达系统和甲醇酵母表达系统，而甲醇酵母表达系统较为常见，以毕赤酵母属(Pichia)应用较多。

酿酒酵母(Saecharomycescerevisiae)被认为是安全性生物，不产生毒素，但酿酒酵母难于高密度培养，分泌效率低，几乎不分泌分子量大于30 kD的外源蛋白质，也不能使所表达的外源蛋白质正确糖基化，而且表达蛋白质的C端往往被截短。因此，一般不用酿酒酵母做重组蛋白质表达的宿主菌。甲醇酵母表达系统是应用较多，甲醇酵母主要有汉森酵母属(Hansenula)，毕赤酵母属(Pichia)，球拟酵母属(Torulopsis)等，并以毕赤酵母属(Pichia)应用为主。利用甲醇酵母表达外源性蛋白质其产量往往可达克级，与酿酒酵母相比其翻译后的加工更接近哺乳动物细胞，不会发生超糖基化。

酵母表达系统是研究真核蛋白质表达和分析的有力工具，一是含有*的强有力的AOX (醇氧化酶基因)启动子,用甲醇可严格地调控外源基因的表达。二是培养成本低，产物易分离，毕赤酵母所用发酵培养基成本合理，一般碳源为甘油或葡萄糖及甲醇，期为无机盐，培养基中不含蛋白，有利于下游产品分离纯化。三是外源蛋白基因遗传稳定，外源基因能以高拷贝数整合到毕赤酵母基因组中，不易丢失并能得到高表达菌株。四是作为真核表达系统，毕赤酵母具有真核生物的亚细胞结构，具有糖基化、脂肪酰化、蛋白磷酸化等翻译后修饰加工功能。

服务内容

百欧泰生物的酵母分泌表达系统采用的宿主是巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)，该表达系统是近年来发展迅速、应用较多的一种真核表达系统。百欧泰生物酵母分泌表达系统服务项目包括：

①重组酵母表达质粒构建；

②重组质粒电转化；

③重组表达子筛选；

④小规模蛋白表达和纯化（24培养基培养产物）。

实验原理

以巴斯德毕赤酵母表达外源基因为例，毕赤酵母中含有两个乙醇氧化酶（Alcohol oxidase, AOX）分别编码基因AOX1和AOX2，两种序列相似。AOX1基因严格受甲醇诱导和调控。当甲醇为碳源时，AOX1启动子可被甲醇诱导，启动乙醇氧化酶的表达，从而用甲醇进行代谢。甲醇酵母的表达载体为整合型质粒，载体中含有与酵母染色体中同源的序列，很容易整合到酵母基因组中，大部分甲醇酵母的表达载体（质粒）中都有甲醇酵母醇氧化酶基因（AOX1），在该基因启动子(PAOX1)作用下，质粒可用来促进编码外源蛋白的目的基因的表达。

实验流程

将目的基因克隆入毕赤酵母表达载体，收获阳性重组表达质粒；

用适当的限制性内切酶消化阳性重组质粒，使之线性化；

将线性化的阳性重组质粒转化人巴斯德毕赤酵母菌株（如GS1 15，KM71）；

将转化物接种HIS4缺陷平板进行初次筛选；

用不同浓度的G418平板进行第二轮筛选；

挑选10~20个克隆进行小规模诱导培养，鉴定外源基因的表达量；

挑选高水平表达菌株进行大规模诱导培养以制备外源基因的表达蛋白质。

实验服务流程

双方沟通一致后确定实验方案，确定服务要求-签订合同—预付款-开始实验-成果交付

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