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BrdU荧光染色
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详细信息
BrdU荧光染色检测原理
用BrdU预处理的细胞中，BrdU可代替胸腺嘧啶核苷插入复制的DNA双链中，而且这种置换可以稳定存在，并带到子代细胞中。细胞经过固定和变性处理后，可用免疫学方法检测DNA中BrdU的含量(如采用鼠抗BrdU单克隆抗体特异识别BrdU,再采用辣根过氧化酶标记的山羊抗鼠IgG二抗标记，最后用比色法或荧光的方法进行定量测定)，从而判断细胞的增殖能力。
BrdU荧光染色实验步骤
1.细胞以1.5×105 /ml细胞数接种于直径35 mm培养皿中(内放置一盖玻片)，培养1 d，用含0.4%FBS培养液同步化3 d，使绝大多数细胞处于G0期。
2.加入BrdU(储液：1.0 mg/ml,终浓度为0.03 μg/ml)，37℃，孵育40min。
3.弃培养液，玻片用PBS洗涤3次。
4.甲醇/醋酸固定10 min。
5.经固定的玻片空气干燥，0.3%H2O2-甲醇30 min灭活内源性氧化酶。
6.5%正常兔血清封闭。
7.甲酰胺100℃，5 min变性核酸。
8.冰浴冷却后PBS洗涤，加1抗即抗小鼠BrdU单抗(工作浓度1：50)，阴性对照加PBS或血清。
9.按ABC法进行检测，苏木素或伊红衬染，在显微镜下随机计数10个高倍视野中细胞总数及BrdU阳性细胞数，计算标记指数(LI)。
注意事项
1.BrdU配制方法：10 mg溶于10 ml双蒸水，4℃下避光保存
2.BrdU会肌体造成不可逆损伤，使用时注意安全，避免吸入BrdU粉尘。
