Luna® 通用探针一步法 RT-qPCR 试剂盒

NEB Luna 通用探针一步法 RT-qPCR 试剂盒经过优化，适用于水解探针法的目标 RNA 序列实时定量。一步法 RT-qPCR 为 RNA 检测和定量提供了一种便捷、强大的方法。在同一管中，RNA 首先由反转录酶转化为 cDNA，然后使用 DNA 依赖型 DNA 聚合酶扩增 cDNA，从而可以进行 qPCR 定量。探针法 qPCR/RT-qPCR 原理是利用聚合酶的 5´→3´ 核酸外切酶活性，将淬灭的目标特异性探针切断发出荧光，并实时监测荧光值的增加，以测量每个循环中的 DNA 扩增。在荧光信号显著超过背景荧光的位置，可以确定循环数或 Cq 值。Cq 值可用于评估两个或多个样品的靶基因相对丰度，通过已知稀释浓度样品的标准曲线，可对靶基因进行绝对定量。

在 Luna 通用一步法探针 RT-qPCR 试剂盒中，联合使用热启动 Taq DNA 聚合酶与新型 WarmStart 反转录酶，通过适配体可逆抑制来双重控制酶活性。这种温控活化机制可避免热循环前的非特异扩增，从而让室温建立体系更安全。经改造的 Luna WarmStart 反转录酶的热稳定性比许多反转录酶更高，其最佳反应温度为 55℃。对于困难靶标/模板，最多可将反转录步骤的温度升至 60℃，不会影响 Luna 性能。

注意：为确保 Luna WarmStart 反转录酶全激活，建议温育温度不低于 50℃。

Luna 通用探针一步法反应混合液浓度为 2X，包含热启动 Taq DNA 聚合酶、dNTP 和所有必需的缓冲液成分。该预混液包含惰性参比染料，可与多种 qPCR 仪器兼容，包括需要高 ROX 或低 ROX 参比信号的仪器。特色的是：预混液还包含可防止交叉污染的 dUTP，以及有助于观察反应体系建立的非荧光可见示踪染料。该示踪染料与 qPCR 常用荧光团的光谱没有重叠，因此不会干扰实时检测。

Luna WarmStart 反转录酶预混液的浓度为 20X，其中包含 Luna WarmStart 反转录酶以及用于防止 RNA 降解的小鼠 RNase 抑制剂（详情请见产品手册中的模板制备）。适用于各种 RNA 样品类型（总 RNA、poly（A）-RNA 等）和来源。

.图 1：NEB 的 Luna 通用探针一步法 RT-qPCR 试剂盒具有更高的灵敏度、更出众的可重复性以及更优异的 RT-qPCR 表现

使用 Luna 通用探针一步法 RT-qPCR 试剂盒，执行了人 GAPDH 基因的 RT-qPCR 靶标检测，起始量模板为 8 个 10 倍梯度稀释的 Jurkat 总 RNA（1 μg – 0.1 pg），每个浓度的样品做 8 个重复。实验按照试剂盒建议的操作流程进行，反应中包含一个 55℃ 温育 10 分钟的反转录步骤，以便于具有热稳定性的 Luna WarmStart 反转录酶发挥作用。

图 2：NEB 的 Luna 通用探针一步法 RT-qPCR 试剂盒在多重检测中展现强大功效

使用 Luna 通用探针一步法 RT-qPCR 试剂盒，执行了人 GAPDH 基因、核糖体蛋白 L32g 和 PI3 激酶相关的激酶 SMG1 基因的多重 RT-qPCR 靶标检测。起始量模板浓度为 7 个 10 倍稀释的 Jurkat 总 RNA（1 μg – 1 pg），每个浓度的样品做 4 个重复。扩增图表如上所示，左边是叠加的结果，右边是每个基因单独的检测结果。若要解释拷贝数的差异，低拷贝的模板（SMG1）使用的引物浓度为 0.4 µM，高拷贝的模板（L32g 和 GAPDH）使用的引物浓度为 0.2 µM。Luna 产品在多重 RT-qPCR 检测中展现出高效率、可重复性、灵敏度和性能。

图 3：通过与市售的探针法 RT-qPCR 试剂相比，Luna 产品展现出更好的稳定性和特异性

使用市售的 RT-qPCR 试剂对 7 个不同丰度、长度和 GC 含量的 RT-qPCR 靶标进行测试。测试均根据产品说明书进行，数据来源于两位实验人员。从以下方面评估了反应结果：扩增效率、低起始量检测能力及无模板扩增值（ΔCq = 无模板对照的平均 Cq – *低起始量的平均 Cq）。此外，还评估了扩增结果的一致性、可重复性和总体曲线质量（质量分数）。柱状图展示了达到可接受的性能标准的目标百分比（由点图上的绿色框表示，质量分数 > 3）。NEB 和其它供应商的结果如下所示：Quanta，qScript™ XLT 1-Step RT-qPCR ToughMix®；ABI，TaqMan® RNA-to-Ct 1-Step Kit；QIAGEN，QuantiFast® Probe RT-PCR Kit；Bio-Rad，iTaq™ Universal Probes One-Step Kit；Promega®，GoTaq® Probe 1-Step RT-qPCR System。NEB 的 Luna 通用探针一步法 RT-qPCR 试剂盒性能优于其它测试试剂。

• 注意事项

1. 引物设计
   使用 qPCR 引物设计软件（如 Primer3），可在尽力减少非特异性扩增和引物二聚体的情况下提高扩增成功率。GC/AT 含量平衡（40 – 60%）的靶标，往往具有最高的扩增效率。若可行，尽量多输入目标周围区域序列，以便引物序列设计更加完善，同时使用检索功能，检索相关序列数据库（避免潜在的非特异性扩增）。建议在已知的 RNA 剪接位点范围内设计引物，防止基因组 DNA 扩增。

2. 引物和探针浓度
   对大多数靶标而言，400 nM（每个引物）的终浓度就可以提供最佳性能。如有必要，可以在 100 – 900 nM 范围内优化引物浓度。为获得最佳结果，探针应包括在 200 nM 的范围内。可以在 100 – 500 nM 范围内优化探针浓度。

3. 多重检测
   在确定要纳入多重检测反应中的荧光团时，一定要选择兼容的荧光发光基团和荧光吸收基团（例如，所选实时仪器可以容纳且荧光光谱重叠度最小）。若为依赖 ROX 的仪器，避免使用 ROX 标记的探针。包含 400 nM 的正向和反向引物，以及反应中要检测的各靶标的 200 nM 探针。对于丰度差异较大的靶标，推荐对丰度较高的靶标使用较低的引物浓度（如 200 nM）。如有必要，根据性能调整浓度（引物 100 – 900 nM，探针 100 – 500 nM）。将 qPCR 方案加载到实时仪器上时，一定要选择适当的光学通道，因为有些仪器的单通道记录模式会妨碍多重检测数据的收集和分析。在尝试进行多重检测之前，应单独测试引物和探针组的功能。

4. 扩增子长度
   为确保成功获得一致的 qPCR 结果，最大限度地提高 PCR 效率非常重要。其中一个重要方面就是设计短片段 PCR 扩增子（通常为 70 – 200 bp）。如果靶标超出范围，可能需要对实验进行优化。

5. 模板制备及相关浓度
   Luna RT-qPCR 与通过传统核酸纯化方法制备的 RNA 样品兼容。为保障长效稳定性，制备好的 RNA 应储存在含有 EDTA 的缓冲液中（如 1X TE）；稀释液应在 qPCR 实验前采用 TE 或水新鲜制备。注意：RNA 模板质量会对 RT-qPCR 效率产生极大的影响。处理 RNA 时应采取适当的预防措施，防止 RNase 或 DNase 污染。强烈推荐使用（提供的）无核酶水。若可行，可使用 DNase I 处理 RNA，将残留基因组 DNA 除去。
   一般来说，标准品和未知样品的有效浓度范围应该在 108 拷贝到 10 拷贝之间。注意：根据泊松分布，对于单拷贝范围内的稀释液，某些样品会包含多个拷贝，某些则不含拷贝。对于总 RNA，Luna 一步法试剂盒可以在 8 个浓度梯度的起始量范围内（1 μg – 0.1 pg）提供良好的线性定量能力。对于大多数靶标，推荐使用 100 ng – 10 pg 的总 RNA 标准起始量范围。对于经纯化的 mRNA，推荐起始量 ≤ 100 ng。对于体外转录的 RNA，推荐起始量 ≤ 109 拷贝。

6. ROX 参比染料

   对于某些实时仪器，建议使用惰性参比染料（通常是 ROX）来避免仪器限制（例如“边缘效应”、气泡、微小体积差异以及反应过程中尘埃或微粒的自发荧光）造成的孔与孔之间的反应误差。不过，对于模板/引物的加样错误、异质混合液和蒸发/凝结问题造成的误差，ROX 校正几乎不起作用。

   以下 Luna® qPCR 产品包含通用惰性参比染料：Luna 通用 qPCR 预混液（NEB #M3003）、Luna 通用探针法 qPCR 预混液（NEB #M3004）、Luna 通用一步法 RT-qPCR 试剂盒（NEB #E3005）和 Luna 通用探针一步法 RT-qPCR 试剂盒（NEB #E3006）。这些产品兼容多种仪器（高 ROX、低 ROX、无 ROX），因此无需额外的 ROX 来进行校正。

   Luna 探针一步法 RT-qPCR 试剂盒（无 ROX）（E3007）不含参比染料，与无需使用 ROX 的仪器兼容。如果需要 ROX 校正，可自行添加 ROX。如需详细信息，请参阅仪器厂商说明书。

7. 防止交叉污染
   RT-qPCR 是一种非常灵敏的方法，在新的 RT-qPCR 测定中，之前扩增反应的产物污染会导致各种问题，例如假阳性结果和灵敏度降低。防止这种“交叉”污染的最好办法就是严格按照实验程序操作，避免扩增后打开反应容器。不过，为进一步满足预防污染的要求，Luna qPCR 混合液中包含了 dUTP/dTTP 混合物，从而可在扩增过程中将 dU 结合到 DNA 产物中。用尿嘧啶-DNA 糖基化酶（UDG）对 qPCR/RT-qPCR 实验进行预处理，通过切除尿嘧啶碱基来消除之前扩增的含尿嘧啶的产物，从而产生不可扩增的 DNA 产物。使用热敏 UDG 至关重要，因为需要将 UDG 全灭活，防止其破坏新合成的 qPCR 产物。
   
   为防止交叉污染，应在反应混合液中添加终浓度为 0.025 U/μl 的南极热敏 UDG（NEB #M0372）。要最大限度地消除污染产物，可在室温下进行 qPCR 实验，或在进行初始变性之前在 25℃ 条件下温育 10 分钟。

8. 反应体系建立与循环条件
   Luna 一步法试剂盒具有双重热启动功能，因此无需在冰上建立反应体系或在使用前预热热循环仪。
   如果采用 96 孔板，推荐使用 20 μl 最终反应体积。
   如果采用 384 孔板，推荐使用 10 μl 最终反应体积。
   对仪器循环条件进行编程时，确保在延伸结束时读取模板读数，并在循环完成后绘制变性（融化）曲线，以分析产物特异性。
   大部分应用只需 40 个循环的扩增，但低起始量样品可能需要 45 个循环。

上海牧荣生物科技有限公司是一家集成服务商，公司坚持“一站式”服务模式，为客户全面解决实验、生产、开发需求。公司整合国际与国内资源，加强网络建设，提高公司内部运作效率，为客户提供方便、快捷的服务。

实验试剂的注意事项:

(1)切忌与皮肤直接接触。

(2)要用洁净的专用取用试剂，用同一种工具不允许同时连续取用多种试剂。应取完一种试剂后，将工具洗净(药勺要擦干)后，才可取用另一种试剂。

(3)易燃易爆性化学试剂必须存放于专用的危险性试剂仓库里，并存放在不燃烧材料制作的柜、架上，温度不宜超过28℃，使用时要穿好必要的防护用具实验室少量瓶装可设危险品专柜，按性质分格贮存，同一格内不得混放氧化剂等性质的抵触品，并根据贮存种类配备相应的灭火设备和自动报警装置。低沸点极易燃烧试剂宜低温下贮存(5℃以下，禁用有电火花产生的普通家用电冰箱贮存。

(4)强腐蚀类 存放处要求阴涼通风，并与其他药品隔离放罟。

(5)强氧化剂试剂是过氧化物或含氧酸及其盐,在适当条件下会发生爆炸,并可与有机物、镁、铝、锌粉、硫等易燃固体形成爆炸混合物。(存放处要求阴凉通风，温度不得超过30℃℃。

(6)放射性类 一般化验室不可能有放射性物质。化验操作这类物质需要特殊防护设备和知识以保护人身安全，并防止放射性物质的污染与扩散

Luna® 通用探针一步法 RT-qPCR 试剂盒